西北农林王丽Anal. Chem.：双酶活性钒纳米球介导的免疫传感器!

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研究内容

酶联免疫吸附试验（ELISA）以其高通量、简便、快速的特点，在免疫检测领域引起了广泛的关注。然而，传统的ELISA通常提供单一信号读出，所用酶的标记能力差，导致低准确度和有限的检测范围。T-2毒素（T-2）是一种由镰刀菌属产生的四环倍半萜化合物，是最有害的三烯a毒素之一。人类和动物通过不同途径意外摄入T-2可导致急性或慢性中毒，严重影响消化系统、免疫系统、神经系统甚至生殖系统。

西北农林科技大学王丽教授建立了一种钒纳米球（VNSs）介导的竞争比纳米酶联免疫吸附试验（VNSs-RNLISA），用于检测T-2。VNSs-RNLISA的检测限为0.021 ng/mL，比单信号纳米酶联免疫吸附试验（0.561 ng/mL）的灵敏度高约27倍。相关工作以“Double-Enzyme Active Vanadium Nanospheres-Mediated Ratiometric Multicolor Immunosensors for Sensitive Detection of the T‑2 Toxin”为题发表在国际著名期刊Analytical Chemistry上。

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研究要点

要点1.作者以2-氨基苯甲酸为有机配体，V3+为金属源，通过一步水热法合成了具有超氧化物歧化酶样和过氧化物酶样双酶活性、高催化效率和优异水分散性的钒纳米球（VNS），并赋予了MOF高比表面积和高负载能力的固有特性。

要点2.基于VNS可氧化1，1-二苯基-2-苦基-肼褪色并催化3，3′，5，5′四甲基联苯胺（TMB）显色。作者巧妙地开发了一种比率纳米酶联免疫吸附法（VNSs-RNLISA），以灵敏地检测T-2。T-2不仅可以用肉眼进行定性测量，还可以通过监测450和517 nm波长处的吸光度比率进行定量评估。

要点3.VNSs标记的抗体探针的表征显示出强烈的双酶活性、优异的稳定性和与T-2的高亲和力[亲和常数（ka）约为1.36×108 M-1]，可以显著提高检测灵敏度。VNSs RNLISA的检测限为0.021 ng/mL，比单信号纳米酶联免疫吸附试验（0.561 ng/mL）的灵敏度高约27倍。此外，吸光度比（Δ450/Δ517）的变化在0.22−13.17 ng/mL的范围内线性下降，超过使用TMB的单模纳米酶联免疫吸附测定的检测范围1.6倍。此外，VNS-RNLISA成功地用于鉴定玉米和燕麦样品中的T-2，回收率为84.216至125.371%。

要点4.该比例多色免疫传感平台主要解决了上述挑战，并具有以下优点：（1）在没有交联剂的复杂活化的情况下，合成的VNS可以通过直接离心吸附mAb来构建VNSs-mAb探针。（2）VNS具有双重酶活性，因此在检测期间可以显示蓝色和紫色的两种颜色变化，并且可以在强烈的颜色对比下实现自校准和提高灵敏度的目的。（3）紫色信号稳步增强，而蓝色信号急剧下降，直到随着T-2浓度的增加而消失。利用两者的比率可以显著扩大检测范围，并满足不同地区对同一目标的不同限制要求。

该工作证明，内置比率比色免疫传感器在检测小分子方面具有更高的准确性和灵敏度，扩大了检测范围，并显示出令人满意的适用性。

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研究图文

图1.（A）VNSs载体的合成程序；（B）VNSs-RNLISA与定量信号和传统ELISA检测T-2的比较。

图2.VNSs的表征。

图3.（A）VNS/TMB/H2O2、VNSs/TMB、TMB/H2O2、VNS/H2O2、VNSs、H2O2和TMB的UV-vis吸收光谱。（B）（a）NBT+Na2EDTA+Met+核黄素，（b）VNS（0.025 mg/mL）+NBT+Na2EDTA+Met+核黄素，(c) VNSs (0.0625 mg/mL)+NBT+Na2EDTA+Met+核黄素，(d) VNSs (0.125 mg/mL)+NBT+Na2EDTA+Met+核黄素，(e) NBT+Na2EDTA+Met+核黄素在黑暗条件下的UV-vis吸收光谱，NBT、Na2EDTA、met和核黄素分别为750 μM、100 μM、130 mM和20 μM。（C，D）在H2O2存在下，速度曲线与TMB浓度的双倒数图和在TMB存在下的速度对H2O2浓度的曲线。

图4.VNSs-mAb探针的表征。

图5.（A）VNSs浓度、（B）抗T-2mAb的量、（C）VNSs-MAb探针的体积、（D）涂覆的T-2-BSA浓度、（E）免疫反应时间和（F）显色时间的影响。

图6. VNSs-RNLISA和T-NLISA检测T-2的测定性能。

图7. VNSs-RNLISA对（A）玉米和（B）燕麦样品中T-2毒素的检测结果。（C）玉米和燕麦样品中不同浓度（5.78和3.85 μg/kg）的T-2分析。（D）VNSs-RNLISA检测到的真实样品中T-2的回收率。

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文献详情

Double-Enzyme Active Vanadium Nanospheres-Mediated Ratiometric Multicolor Immunosensors for Sensitive Detection of the T ‑ 2 Toxin

Haiyu Wu, Tong Bu, Yuanyuan Cao, Ying Wang, Jia Xi, Mingyan Li, Ruixia Li, Pei Jia, Li Wang*

Anal. Chem.

DOI:10.1021/acs.analchem.2c05197

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