USB1是miRNA去腺苷酶，修饰miRNA来调控造血发育

撰文 | Enigma

责编 | 酶美

嗜中性白血球减少症(PN) 为皮癣常染色体隐性骨髓衰竭(BMF) 综合征与先天性角化不良(DC) 的临床重叠。然而，与DC患者不同，PN患者的端粒并不缩短，这为PN的确诊提供了一个可区分的特征。已有研究发现，PN患者在人类基因C16orf57中存在不同程度的突变，该基因负责编码保守的3 '到5 ' RNA外切酶USB1。USB1是U6和U6atac小核RNAs (snRNAs) 的加工所必需的，以往在使用USB1缺失的酵母和斑马鱼模型时研究时观察到一些RNA剪接过程中的缺陷。并且USB1的突变导致PN和BMF患者的造血功能衰竭。然而，来自PN患者的淋巴母细胞却并没有表现出U6 snRNA水平的降低，并且pre-mRNA剪接也是正常的。这些结果表明usb1介导的PN是一种奇异的BMF综合征，其潜在的遗传原因已被确定，但导致组织衰竭的分子机制尚不清楚。

2023年3月3日，美国华盛顿大学的Luis Francisco Zirnberger Batista和科罗拉多大学博尔德分校的Andre Levchenko教授合作在Science发表了题为USB1 is a miRNA deadenylase that regulates hematopoietic development的研究论文。他们构建了包含USB1功能丧失型突变体的人类胚胎干细胞 (hESCs)，并通过进一步的生化细胞研究证实该突变会损害人类造血功能。接下来的机制研究发现，在血液发育过程中，USB1突变体中的microRNA (miRNA) 水平失调会导致无法去除非典型polyA聚合酶-PAPD5/7添加的3 '端腺苷化尾，最终导致造血衰竭的发生。并且通过使用PAPD5/7的抑制剂来处理USB1突变体细胞系，可以调节miRNA 3 '端腺苷酸化，进而挽救USB1突变体的造血功能障碍。这项工作表明USB1作为miRNA的去腺苷化酶发挥其对造血功能的调控，并提示我们抑制PAPD5/7未来可以作为PN的一种潜在治疗方法。

在本研究中，为了更好地研究USB1在生理状态下的作用机制，作者首先利用CRISPR-Cas9技术构建了包含频繁发生c.531_del_A突变的USB1（简称USB1突变体）的人类胚胎干细胞系 (hESCs)。在这个细胞系中，USB1的功能是丧失的，接着作者通过生化细胞实验发现该细胞系仍然具有正常的核型、生长速度和端粒长度，且具备多能性，这表明临床相关的USB1突变在未分化的hESCs中是不受影响的。接下来，为了进一步阐明USB1在造血过程中的作用，作者又通过无血清造血分化，从hESCs中获得造血祖细胞。研究发现，USB1突变细胞在造血分化的早期阶段并没有表现出任何损害，包括中胚层的形成(第3天和CD34+/CD43−造血内皮细胞 (HE) 群体 (第8天)。然而，与野生型 (WT) 细胞相比，USB1突变细胞中CD45+造血祖细胞的形成 (第16天) 明显减少。并且造血集落潜能分析结果也显示USB1突变细胞集落形成受损，表明USB1功能缺失突变对造血功能有负面影响。此外，作者还通过分析WT和USB1突变细胞中中性粒细胞形成的潜力，发现USB1突变体中CD15+ /CD66b+谱系的形成明显减少，表明中性粒细胞发育异常。而WT USB1蛋白的加入能够挽救这些细胞的造血潜能。这些研究结果进一步确认了USB1在调控造血功能中的重要性。USB1突变体hESCs会损害造血发育。

接下来，作者在进一步研究USB1调控造血的机制中发现，在U6 snRNA成熟过程中U6 3 '端会被腺苷化，并且这个过程需要USB1进行去腺苷化和尿苷化尾部的修剪。而USB1突变导致3'腺苷化增加，但不影响人类干细胞和造血祖细胞中U6 snRNA的水平。这表明USB1可能会通过改变其他RNA来影响造血。紧接着作者又分析了USB1突变与野生型的基因组和表达差异情况，发现USB1突变对分化造血祖细胞和成熟血细胞的基因表达有更大的影响，这与在这些特定分化阶段USB1水平的增加密切相关。此外，研究还发现尽管USB1突变不影响U6水平和pre-mRNA剪接，但它损害了关键造血和中性粒细胞发育途径的正确激活。说明USB1突变在血液发育过程中会影响mRNA水平，但不损害剪接。进一步的研究数据表明USB1可以通过miRNA稳态调节造血发育，并且在USB1突变体的靶向造血发育过程中，miRNA水平会逐渐发生改变。

紧接着作者又对USB1突变体影响miRNA水平的机制进行进一步的探究，发现许多表达水平降低的miRNAs在USB1突变体中表现出3 '腺苷化的增加。研究者预测USB1可以通过去腺苷化miRNA并调节其稳定性。在USB1突变体中，通过抑制PAPD5/7调节miRNA 3‘polyA尾链可挽救miRNA水平并恢复造血输出，说明抑制PAPD5/7可能是治疗这些患者的潜在治疗策略。然而，使用PAPD5/7的抑制剂RG7834治疗并没有挽救延长的U6 3 '端，这也进一步支持PN的造血衰竭独立于U6。

最后，作者通过在USB1突变体的hESCs中设计组成型表达miR-125a-5p, miR-142-5p, miR-199a-3p和miR-223-3p后，发现红细胞和髓系造血输出均恢复到与WT细胞相似的水平。此外，用靶向miR-125a-5p, miR-142-5p, miR-199a-3p和miR-223-3p的miRNA抑制剂来处理WT CD34+造血细胞，会导致其集落形成能力显著下降。这些结果表明，在USB1突变体中观察到的造血衰竭与这些miRNAs的受损水平直接相关，挽救miRNA水平恢复USB1突变体的造血发育。

综上所述，本研究首次发现并证明了USB1对miRNA的去腺苷化功能，通过限制它们的降解和增加它们的丰度，调控了造血功能。这将USB1确定为第二种去尾酶，它与PARN类似，可以从ncRNAs中去除寡核苷酸(a)尾，以增强其稳定性。抑制负责miRNA腺苷化的酶PAPD5和PAPD7，挽救了USB1突变细胞中观察到的造血缺陷。本研究为在USB1突变患者中观察到的发病机制提供了的分子机制，并提示PAPD5/7抑制剂未来很可能是PN患者的一种治疗选择。

http://doi.org/10.1126/science.abj8379

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