农林2区-if5.56-年刊2k+西北高原生物所揭示黑果枸杞花青素可缓解氧化应激诱导的衰老相关肝损伤和异常氨基酸代谢

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导读

近年来，黑果枸杞中花青素（LRA）与健康的关系越来越受到关注。本研究旨在通过构建D-半乳糖（DG）诱导的衰老大鼠模型，探讨LRA的抗衰老作用及其机制。我们的结果表明，长期摄入LRA 8周后可改善衰老大鼠的运动功能，降低血清衰老标志物，促进内源性抗氧化系统，并抑制血清炎症细胞因子。此外，LRA处理通过减轻炎症和抑制Fas/FasL介导的细胞死亡来减轻DG诱导的肝损伤。更重要的是，LRA恢复了衰老大鼠的异常血清代谢组谱，涉及38种代谢产物和44种途径。具体而言，LRA通过调节L-苏氨酸、L-天冬氨酸、甘氨酸、L-组氨酸、D-同型半胱氨酸、L-同型瓜氨酸、L-高丝氨酸、胍基乙酸和犬尿氨酸的水平，显著影响氨基酸和蛋白质相关代谢途径。这些结果对LRA作为抗衰老和肝脏保护成分的开发具有重要意义。

论文ID

原名：Long-Term Dietary Lycium ruthenicum Murr. Anthocyanins Intake Alleviated Oxidative Stress-Mediated Aging-Related Liver Injury and Abnormal Amino Acid Metabolism

译名：长期摄入黑果枸杞中花青素可缓解氧化应激介导的衰老相关肝损伤和异常氨基酸代谢

期刊：Foods

IF：5.561

发表时间：2022.10

通讯作者：胡娜

通讯作者单位：中国科学院西北高原生物研究所

实验结果

1. 体重、运动能力和血清老化指标

为了研究在衰老过程中长期饮食摄入LRA的影响，DG处理的大鼠同时通过灌胃给予LRA（每天一次，持续8周）。大鼠在解剖实验前称量体重。如表1所示，生理盐水对照组（NC）、DG，以及D-半乳糖加LRA处理（DG+LRA）组的体重没有显著差异。DG组的大鼠表现出运动功能受损，与NC组相比，游泳速度明显降低。然而，LRA摄入量通过提高DG处理大鼠的游泳速度，显著改善了它们的运动功能。

表1体重、游泳速度和血清衰老相关生物标志物，包括AGEs、MDA、金属硫蛋白、GSH、抗氧化酶和炎症因子

NC，正常对照组；DG，D-半乳糖；LRA，黑果枸杞花青素。数值表示为平均值± SD（n=9）。#与NC组显著不同。*与DG组有显著差异。#或*，p < 0.05，**或##，p < 0.01，***或###，p < 0.001。

衰老伴随着包括AGEs和脂质过氧化产物（MDA）在内的氧化产物的积累。结果表明，DG组血清AGEs和MDA含量明显高于NC组，而其水平在LRA摄入后显著降低。

相反，DG组的非酶抗氧化剂（包括金属硫蛋白和GSH）以及抗氧化酶（包括GSH-Px、CAT和T-SOD）的血清浓度显著低于NC组。然而，摄入LRA后，这些抗氧化成分的浓度显著增加。因此，LRA可以改善大鼠内源性抗氧化系统，从而减轻DG诱导的氧化应激。

此外，与NC组相比，DG组血清促炎细胞因子（TNF-α和IL-6）显著升高，而抗炎细胞因子（IL-10）显著降低。然而，摄入LRA后，血清TNF-α、IL-6和IL-10恢复。

2. LRA对肝损伤的影响

由于DG主要在肝脏中代谢，它可能对肝脏有很大影响。组织学评估提供了DG和LRA对肝脏影响的视觉证据。如图1A所示，NC组的肝细胞具有保存完好的细胞质和突出的细胞核和核仁。DG组肝细胞结构不清晰，细胞坏死增加，而LRA处理后这些组织学损伤有所改善。这一证据表明，LRA对DG诱导的肝损伤具有潜在的保护作用。

图1 LRA对DG致衰老大鼠肝脏的保护作用

（A）肝脏HE染色（×400）。红色箭头表示细胞坏死。（B–D）血清AST、ALT和LDH水平（n=9）。（E）肝脏TNF-α表达的免疫组化分析。（F）TNF-α阳性细胞的定量分析（%面积）（n=3），（G，H）mRNA在肝脏中的表达（n=3）。数值表示为平均值± SD。*p < 0.05、**p < 0.01和**p < 0.001。

天冬氨酸转氨酶（AST）和丙氨酸转氨酶（ALT）通常存在于肝细胞中，在肝脏炎症或功能障碍时，它们被释放到血流中。血清AST和ALT活性反映肝损伤程度。如图1B，C所示，DG组的血清AST和ALT活性明显高于NC组。LRA摄入量明显降低衰老大鼠血清AST和ALT水平。

乳酸脱氢酶是细胞损伤时释放的一种细胞内酶，它也反映了炎症水平。与NC组相比，DG组的血清乳酸脱氢酶（LDH）浓度显著升高，而DG+LRA组的LDH血清水平低于DG组（图1D）。总的来说，LRA摄入对DG诱导的肝损伤具有保护作用，并减少了AST、ALT和LDH的释放。

3. LRA对DG诱导的肝脏炎症和Fas/FasL激活的影响

免疫组化分析结果显示，DG诱导了肝脏炎症，如TNF-α阳性（TNF-β+）细胞增加所示（图1E，F）。然而，摄入LRA后，肝脏中TNF-α的表达显著下调，提示LRA可抑制DG诱导的肝脏炎症。

Fas/FasL参与细胞死亡受体信号传导。我们的qRT-PCR结果显示，与NC组相比，DG组大鼠肝脏中Fas/FasL mRNA的表达显著上调（图1G，H）。LRA处理可降低衰老大鼠Fas/FasL mRNA的表达水平，表明LRA可通过抑制Fas/Fas L的活化来减轻DG诱导的肝细胞死亡。

4. LRA对血清代谢组谱的影响

通过对血清样品进行基于LC-MS/MS的代谢组学分析，我们共鉴定了514种代谢物。我们进行主成分分析（PCA）以研究NC、DG和DG+LRA组的代谢组差异。PCA得分图如图2A所示，第一和第二主成分的得分分别为12.96%和11.72%。NC组和DG组的血清代谢组有明显差异。然而，LRA摄入后恢复了这种变化。为了最大化组间的区别，我们进行了正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA），并显示在图2B、C。所建立的模型具有良好的预测可靠性（R2Y = 0.99，Q2 = 0.434）。

图2 LRA对DG诱导衰老大鼠（n=8）血清代谢的影响

（A）2D PCA得分图。（B）OPLS-DA得分图。（C）火山图。（D）维恩图显示了各组不同代谢物之间的关系。红点，VIP≥ 1；绿点：VIP＜1。

5. 筛选差异代谢物

我们根据倍数变化≥ 1.2，VIP≥ 1且p < 0.05筛选差异代谢物。DG处理后，106种血清代谢物的含量发生了显著变化，其中38种代谢物在摄入LRA后恢复（图2D）。这38种差异代谢物被认为是潜在的生物标志物，参与了LRA对DG诱导衰老的改善。聚类热图（图3）显示了各组生物标志物的相对增加或减少情况。

不同的代谢物根据其化学性质分为不同的类别。如表2所示，DG上调了氨基酸代谢组（L-苏氨酸、L-天冬氨酸、甘氨酸、L-组氨酸），有机酸代谢组学（L-高丝氨酸、4-甲氧基肉桂酸、N-油酰基甘氨酸、5-氨基戊酸、胍基乙酸、3-羟基马尿酸、磷酸三乙酯），脂质包括顺-11,14,17-二十碳三烯酸（C20:3）、苯和取代的衍生物（间香豆酸、水杨酸、4-羟基马尿酸、4-乙基苯甲酸），以及其他（1-辛烯-3-酮、6-甲基-5-庚烯-2-酮、（+）-冰片、对盖-1-烯-4-醇）的水平，而它们的水平在LRA摄入后恢复到NC组。

图3差异代谢物聚类热图

表2血清差异代谢物及其KEGG丰富的通路

#DG对比NC的变化趋势。*DG+LRA对比DG的变化趋势。

同时，氨基酸代谢组（D-同型半胱氨酸和L-同型瓜氨酸）、有机酸代谢组（1-甲基尿酸、吲哚丙烯酸、犬尿氨酸、尿酸），辅酶和维生素，包括三磷酸硫胺、脂质（十六烷二酸、十九烷酸、二氢(神经)鞘氨醇、10-十一烯酸），碳水化合物，包括木糖、吲哚及其衍生物（吲哚-3-甲醛、5-羟基吲哚-3-乙酸、甲基吲哚-乙酸），苯和取代衍生物包括2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚，以及其他（对羟基苯甲酸丙酯和1,2-二氯乙烷）的水平被D-半乳糖下调，LRA处理后可上调。

6. KEGG功能注释与富集分析

为了分析LRA对衰老大鼠代谢途径的影响，我们进行了代谢途径富集分析。根据KEGG数据库，我们对选定的38种差异代谢物进行注释（表2）。KEGG途径富集显示，总共有44条途径与LRA的抗衰老作用相关。LRA尤其影响氨基酸生物合成、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢、氨酰基tRNA生物合成、ABC转运蛋白、半胱氨酸和蛋氨酸代谢等途径（图4）。

图4 前20个显著富集的通路

花青素对健康有益，包括抗氧化、抗炎、肝脏保护作用、神经保护作用，以及改善其他与年龄相关的慢性代谢障碍。本研究在DG诱导的加速衰老大鼠模型中研究了LRA的抗衰老作用。我们发现长期使用DG或LRA处理8周对大鼠的体重没有影响。这一结果与早先的一项研究不同，该研究报告了DG引起的小鼠体重显著下降。我们认为这可能是因为当前研究中的DG剂量（100 mg/kg）远低于早期研究中使用的剂量（300 mg/kg）。衰老通常伴随着虚弱和运动功能下降。摄入LRA可以改善衰老大鼠受损的运动功能，DG+LRA组的游泳速度明显快于DG组。

DG的代谢过程可以诱导活性氧（ROS）的产生。在生理条件下，内源性抗氧化系统（AOS），包括非酶抗氧化剂，如金属硫蛋白和谷胱甘肽，以及酶组分，如GSH-Px、SOD和CAT，可以防止细胞受到ROS的损伤。然而，受损的AOS会引起过量的ROS积累，导致糖氧化和脂质过氧化反应，使得AGEs和MDA水平升高。这些增加的AGEs和MDA水平可能导致与衰老相关的疾病，包括各种器官的氧化损伤、炎症、神经变性疾病、糖尿病和血管并发症。因此，它们被认为是衰老的生物标志物。在这里，我们观察到DG诱导的衰老大鼠血清AGEs和MDA水平升高。相反，DG组的血清金属硫蛋白和谷胱甘肽水平降低，谷胱甘苷过氧化物酶、超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活性降低。然而，长期摄入LRA可通过增加金属硫蛋白、GSH、GSH-Px、SOD和CAT的浓度来改善内源性AOS，从而减少衰老大鼠体内氧化产物的积累。DG诱导的持续氧化应激可通过多种信号通路激活炎症反应。慢性炎症也是衰老的标志，也是许多与衰老相关疾病的驱动因素。我们的数据显示DG诱导的衰老大鼠血清中促炎细胞因子（TNF-α和IL-6）升高，但抗炎细胞因子（IL-10）降低。重要的是，LRA的摄入可以将这些血清炎症因子恢复到正常水平。所有这些结果表明，LRA可以作为一种具有有效抗氧化和抗炎活性的天然药物。

肝脏作为重要的代谢器官，在各种代谢产物的解毒中起着重要作用。由于氧化损伤，肝功能随着年龄的增长而逐渐减弱。正如预期的那样，我们的结果表明DG处理导致肝细胞死亡增加，血清AST、ALT和LDH活性升高。LRA通过减轻这些病理变化和减少AST、ALT和LDH的释放，对肝脏发挥保护作用。事实上，膳食花青素的肝脏保护作用已被广泛证实，如减轻饮食诱导的肝脂肪变性，改善化学诱导的肝纤维化和致癌，减轻非酒精性脂肪肝相关炎症，其机制与它们的抗炎特性有关。

免疫组化结果显示，LRA可通过降低促炎因子（TNF-α）的过度表达来抑制DG诱导的肝脏炎症。饮食中花青素对炎症的影响已被广泛讨论。我们之前的研究还表明，LRA可以减轻大鼠的神经炎症和痛风性关节炎。此外，qRT-PCR结果表明，LRA还可以抑制DG诱导的Fas/FasL活化，从而抑制大鼠肝脏细胞死亡。结合上述分析，LRA可能通过抑制氧化应激和炎症以及抑制Fas/FasL介导的细胞死亡来保护肝脏免受DG诱导的损伤。LRA的肝保护作用及其机制，尤其是在衰老过程中，值得进一步探讨。

肝损伤可导致代谢紊乱，尤其是人体内的氨基酸代谢紊乱。衰老过程伴随着代谢物的变化。许多与衰老相关的疾病，包括糖尿病、肾病、高脂血症、高尿酸血症、骨质疏松症和营养不良，都与代谢功能障碍有关。我们先前的研究表明，D-半乳糖诱导的衰老大鼠海马代谢组发生了变化。在此，我们采用基于LC-MS/MS的代谢组学方法，结合多元数据分析，研究长期摄入LRA对DG诱导的衰老大鼠血清代谢组的影响。结果表明，DG组血清代谢组明显改变。用LRA处理后，失调的血清代谢组恢复到与NC组相同的水平。这可能是由于LRA的肝脏保护作用，减少了衰老大鼠的血清代谢紊乱。

氨基酸不仅被认为是能量来源，而且被认为是激活信号转导途径的信号转换器。氨基酸代谢在衰老和年龄相关疾病中特别敏感。血清代谢组学分析表明，有六种潜在的生物标志物与氨基酸的生物合成有关。其中L-苏氨酸、L-天冬氨酸、甘氨酸和L-组氨酸水平上调，而D-同型半胱氨酸和L-同型瓜氨酸的水平被DG处理下调。L-苏氨酸、L-天冬氨酸、L-组氨酸和甘氨酸水平的升高也参与了氨基酰基tRNA生物合成的紊乱。除了D-同型半胱氨酸的异常水平外，L-天冬氨酸和L-高丝氨酸也表明半胱氨酸和蛋氨酸代谢紊乱，这在血管炎症、肝病和慢性肾衰竭中起作用。此外，L-苏氨酸水平升高与异常的肌肉脂质积累有关。在这里，LRA的摄入减轻了DG对这些代谢物的影响，并可能降低与年龄相关的肝、肾、心血管和脑血管疾病的风险。

我们还发现了五种与甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢相关的潜在生物标志物。除了上文所述的L-苏氨酸、L-天冬氨酸和甘氨酸外，DG处理还上调了L-高丝氨酸和胍基乙酸的水平。甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢紊乱，通过影响肝脏的解毒和氧化还原平衡参与衰老过程。正如预期的那样，LRA显著地将这些代谢物恢复到正常水平，证明了花青素的肝脏保护作用。

LRA还显著恢复了衰老大鼠中有机酸代谢物的水平，如4-甲氧基肉桂酸、N-油酰基甘氨酸、5-氨基戊酸、3-羟基马尿酸、磷酸三乙酯、1-甲基尿酸、吲哚丙烯酸、犬尿氨酸和尿酸。其中，犬尿氨酸是色氨酸分解代谢产生的代谢物，可调节宿主微生物群的免疫细胞反应和神经元兴奋性。犬尿氨酸的降低可能与衰老大鼠免疫细胞功能受损和促炎细胞因子升高有关，而LRA的摄入可使衰老大鼠犬尿氨酸水平恢复。肠道菌群是犬尿氨酸的重要来源，因此，LRA可能通过调节衰老大鼠肠道菌群来恢复犬尿氨酸水平。LRA通过改变肠道微生物群的抗衰老机制有待进一步研究。

如前所述，LRA对DG诱导的衰老大鼠的健康促进作用主要是通过调节氨基酸和蛋白质相关代谢通路来应对衰老相关疾病。另一种功能性资源虾青素也被发现可以通过调节N-乙酰-L-亮氨酸、N-乙酰-L酪氨酸和蛋氨酸的水平来纠正衰老过程中氨基酸代谢的问题。因此，通过调节氨基酸代谢来研究功能性食品的抗衰老机制具有重要意义。

结论

在目前的研究中，我们在DG诱导的加速衰老大鼠模型中评估了LRA的抗衰老功能。LRA的摄入显著降低了衰老大鼠的血清衰老相关标志物水平，增强了内源性抗氧化系统（AOS），并抑制了炎症。此外，LRA可以通过抑制促炎因子和抑制Fas/FasL介导的细胞死亡来减少DG诱导的肝损伤。同时，LRA还能恢复衰老大鼠的异常血清代谢组。具体而言，LRA通过调节L-苏氨酸、L-天冬氨酸、甘氨酸、L-组氨酸、D-同型半胱氨酸、L-同型瓜氨酸、L-高丝氨酸、胍基乙酸和犬尿氨酸的水平，显著影响氨基酸和蛋白质相关代谢途径。总之，LRA可能抵抗氧化应激和炎症，减轻肝脏损伤，改善异常氨基酸代谢，从而减少与衰老相关的疾病。

原文链接： https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36359989/

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