张笑天合作团队揭示突变NPM1蛋白在急性髓系白血病发生中分子机制

NPM1蛋白在细胞生命活动中起到了多种重要作用，包括核仁形成，组蛋白分子伴侣等重要功能。有趣的是，NPM1蛋白在约1/3的急性髓系白血病(AML)中发生移码突变。这一移码突变导致突变NPM1蛋白C端核仁定位信号缺失，并获得额外的NES信号从而完全改变了突变NPM1蛋白的细胞亚定位(核仁到细胞浆) (图1) (1)。NPM1突变在AML中发生及其频繁，并和HOXA基因簇基因，MEIS1基因的高表达密切相关。然而造成HOXA/B MEIS1高表达的具体分子机制并不清晰。

图1. NPM1突变及亚细胞定位改变

12月2日，德克萨斯大学休斯顿健康中心(University of Texas McGovern Medical School) 张笑天课题组联合宾夕法尼亚大学万里玲，加州理工大学种莎莎课题组在Cancer Discovery 上发表题为“Mutant NPM1 hijacks transcriptional hub to maintain pathogenic gene programs in acute myeloid leukemia”的研究长文。第一次系统性揭示了突变NPM1蛋白(NPM1c) 结合基因组区段通过转录劫持(transcriptional hijacking)维持HOXA基因簇基因，MEIS1基因的高表达的分子机制。哈佛医学院Scott Armstrong课题组同时在Cancer Discovery发表背靠背文章揭示了相似的结论(论文题目：Mutant NPM1 directly regulates oncogenic transcription in acute myeloid leukemia )。

在前期实验中，作者发现针对NPM1c和NPM1-WT的抗体可以有效的区分突变和野生型的NPM1. 利用免疫荧光染色，作者NPM1c在细胞核和细胞浆形成50-200nm尺寸的凝聚体(condensate),迥异与NPM1-WT在核仁中的大量富集（图2）。

图2 NPM1c与NPM1-WT免疫荧光染色

作者继而通过CUT&RUN技术使用NPM1c与NPM1-WT的特异抗体检测到NPM1-WT富集在核糖体DNA重复序列（rDNA array）上，而NPM1c丧失结合rDNA array的能力，但获得了与基因组活跃启动子和增强子的结合能力。尤其是结合在NPM1c AML中高表达的基因如HOXA基因簇基因，MEIS1基因上。重要的是，作者利用CRISPR/Cas9 knock-in NPM1c degron system 的OCI-AML3细胞系 （带有NPM1c突变）（2）， 用dTAG-13处理细胞并降解NPM1c 蛋白后，NPM1c CUT&RUN信号随之消失（图3）。这个结果证明了NPM1c确实结合在NPM1c AML基因组内的活跃启动子和增强子。进一步，作者用dTag-13短时间内(<6hr)降解NPM1c蛋白，可以观察到RNA 聚合酶PolII从NPM1c靶基因上迅速消失。同样的SEC复合物重要亚基ENL,MLL复合物重要亚基Menin从NPM1c靶基因上也在dTAG-13短时处理后迅速消失。同时，作者利用BRU-seq检测新生RNA转录发现NPM1c降解后靶基因的新生RNA转录及转录延长也出现大量下降的趋势。

图3. NPM1-WT与NPM1c的基因组结合区域 （rDNA重复序列与HOXA cluster, MEIS1区域）

这个结果说明NPM1c劫持了转录机器并且维持在NPM1c靶基因上的活跃转录。然而NPM1并不包含已知与RNA PolII结合序列。考虑到野生型NPM1蛋白序列中有1/3是无序序列，作者提出NPM1c的对PolII的转录劫持有可能是通过无序序列间的异质互作，利用种莎莎课题组于2018年发展的chromatin LacI-LacO assay，作者证实了NPM1c-LacI 在结合基因组LacO array后确实可以招募PolII(图4)。

图4. NPM1c维持RNA PolII的基因组结合。NPM1c可在结合染色质后招募RNA PolII

NPM1c可以劫持转录，然而是否NPM1c可以如转录因子一样起始转录并不清楚。于是作者在dTAG-13将NPM1c降解完全后，洗除dTAG-13使NPM1c水平重新回复降解前水平。出乎意料的是，HOX gene表达并不能回复NPM1c降解前水平，且细胞开始大量分化。这说明在NPM1c降解后，抑制性染色质调节因子在NPM1c靶基因上被立即激活。通过CUT&RUN作者发现NPM1c蛋白水平回复后仍可结合在HOXA 基因簇及其它最强结合的靶基因上，但相应区域如HOXA基因簇的H3K27ac显著降低，并且H3K27ac水平不能随NPM1c恢复结合而恢复（图5)。这提示了组蛋白去乙酰化酶（HDAC) 可能在NPM1C去除后迅速改变了染色质状态。通过HDAC inhibitor与dTAG-13共处理NPM1c degron细胞。作者发现HDAC inhibitor 处理可以逆转dTAG-13造成的HOX gene表达下调。从而证明了NPM1c在染色质上拮抗HDAC，阻止HDAC沉默HOXA gene表达（图5)。

图5. NPM1c在靶基因上拮抗HDAC

以上实验说明NPM1c不能起始转录，只能维持或增强已有转录。从这一系列实验，我们也能得出结论:NPM1c的转录劫持发生在HOXA/B基因簇基因和MEIS1开始被沉默的血液干祖细胞中。因为NPM1c的存在同时导致了HOXA/B基因簇基因和MEIS1不能通过HDAC介导而沉默，从而导致细胞不能正常分化，发生白血病（图6）。

图6.NPM1c白血病发生模型

作者进一步探究了NPM1c的转录增强功能。在HOXA/B cluster都被沉默的HOXB8永生化小鼠骨髓细胞中，作者利用CRISPR/Cas9敲进NPM1c-GFP。在获得的NPM1c-GFP细胞中HOXA/B基因簇不能被激活，因为在野生型HOXB8细胞中HOXA/B cluster已经完全被H3K27me3覆盖，转录不再活跃。但NPM1c-GFP的敲进引起了其它野生型HOXB8细胞中高表达基因的增强。进一步证明了NPM1c的转录增强功能。

作者同时发现NPM1c的基因组结合依赖于NPM1c和核转运蛋白XPO1的相互作用。XPO1抑制剂可以显著降低HOXA 基因表达并促进分化，并可以显著降低NPM1c在活跃基因组区域的结合。联合使用进入临床实验的MLL-Menin抑制剂（3）和XPO1抑制剂可以协同性促进NPM1c+ AML分化,抑制HOX基因表达，并且在PDX模型中降低了白血病负担， 展示了对NPM1c AML进行精准治疗的良好前景。

David Wang, 范丹丹（温州医科大学), 韩沁钰（加州理工大学），刘易曼（宾夕法尼亚大学）为本项研究的共同第一作者。苏建忠博士课题组（温州医科大学）在这项研究中做出了重要贡献。张笑天博士是本项研究的最后通讯作者。

张笑天博士在德克萨斯大学休斯顿健康中心建立独立实验室，将继续深入研究突变NPM1蛋白在AML发生及进展中的分子机制。张博⼠2010年毕业于复旦⼤学，2016年年于Baylor College of Medicine师从美国医学院院士，表观遗传与血液干细胞专家 Margaret Goodell获得博士学位。2017-2022年于Van Andel Institute, University of Michigan先后担任special fellow, research scientist等职位。以通讯作者第一作者发表于Cancer Discovery, eLife, Molecular Cell; Nature Genetics, Nature Communications等知名期刊。课题组气氛活跃，经费充足，其实验室有2个博士后职位空缺，欢迎有兴趣的研究者直接发送简历至邮件（xiaotian.zhang@uth.tmc.edu）联系申请。

原文链接: https://doi.org/10.1158/2159-8290.CD-22-0424

参考文献

1. Falini B, Brunetti L, Sportoletti P, Martelli MP. NPM1-mutated acute myeloid leukemia: from bench to bedside. Blood 2020;136(15):1707-21 doi 10.1182/blood.2019004226.

2. Brunetti L, Gundry MC, Sorcini D, Guzman AG, Huang YH, Ramabadran R, et al. Mutant NPM1 Maintains the Leukemic State through HOX Expression. Cancer Cell 2018;34(3):499-512 e9 doi 10.1016/j.ccell.2018.08.005.

3. Klossowski S, Miao H, Kempinska K, Wu T, Purohit T, Kim E, et al. Menin inhibitor MI-3454 induces remission in MLL1-rearranged and NPM1-mutated models of leukemia. J Clin Invest 2020;130(2):981-97 doi 10.1172/JCI129126.

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