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普林斯顿大学颜宁再发顶刊!解析人类电压门控钙离子通道结构

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R型电压门控Ca2+ (voltage-gated Ca2+, Cav)通道Cav2.3在神经元和神经内分泌细胞中广泛表达,是治疗疼痛、癫痫、癫痫和帕金森氏症的潜在药物靶点。尽管这些通道具有重要的生理作用,但缺乏靶向这些通道的选择性小分子抑制剂。高分辨率结构可能有助于合理的药物设计。

2022年11月30日,普林斯顿大学颜宁教授与武汉大学药学院高帅教授合作在Nature Communications杂志在线发表题为“Structures of the R-type human Cav2.3 channel reveal conformational crosstalk of the intracellular segments”的研究论文,该研究报道了人类Cav2.3与α2δ−1和β3亚基复合物的冷冻电镜结构,总体分辨率为3.1 Å。

另外,2022年11月22日,普林斯顿大学颜宁与高帅在Cell杂志在线发表题为“Structural basis for the severe adverse interaction of sofosbuvir and amiodarone on L-type Cav channels”的研究论文,该研究对胺碘酮或sofosbuvir单独处理或sofosbuvir/MNI-1与胺碘酮联合处理的Cav1.1和Cav1.3进行了系统的冷冻电镜结构分析。发现胺碘酮单独占据二氢吡啶的结合位点,而sofosbuvir单独使用时不在通道中。在胺碘酮存在的情况下,sofosbuvir/MNI-1通过与胺碘酮的特异性相互作用锚定在孔域的中央空腔中,直接阻断离子渗透路径。总之,这项研究揭示了两种药物在Cav通道支架上的物理、药效学相互作用的分子基础。

电压门控钙离子(Cav)通道渗透Ca2+内流响应膜去极化。它们调节广泛的生理过程,如肌肉收缩、神经递质释放、激素分泌和细胞死亡。根据核心α1亚基的系统发育,将哺乳动物Cav通道的10个主要亚型分为3个亚科,分别为Cav1、Cav2和Cav3。由于其独特的电生理特性,Cav1和Cav3通道又分别被称为l型和T型通道。Cav2的三个成员,分别是Cav2.1的P/ Q型、Cav2.2的N型和Cav2.3的R型,在中枢和外周神经系统的信号转导中起着重要作用。

对Cav通道的系统结构分析不仅可以揭示其工作原理的分子基础,还可以促进针对各种Cav通道疾病的药物研发。得益于单粒子冷冻电镜显微镜(cryo-electron microscopy, cryo-EM)的分辨率革命,自2015年以来,该团队已经解决了每个Cav亚族,Cav1.1, Cav1.3, Cav2.2和Cav3.1的代表性成员的高分辨率结构。这些结构揭示了Cav通道的共同体系结构。α1亚基的跨膜区域都共享典型的电压门控离子通道褶皱,其中4个同源重复序列(指定为I-IV),每个重复序列包含6个跨膜螺旋(S1-S6),以结构域交换的方式相互交错。四组S5和S6节段包围了中央孔隙域(pore domain, PD),负责选择性Ca2+渗透。每个重复的S1-S4段构成电压敏感域(voltage sensing domains, VSD),VSD随着膜电位的变化发生构象变化,将电信号传输到孔门。

特别值得注意的是,一个内源性的磷脂酰肌醇4,5-二磷酸(phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate, PIP2)分子被发现附着在人Cav2.2内膜小叶上VSDII和PD的界面上。此外,异常长的S6II段后面是两个连续的螺旋,分别为CH1II和CH2II,它们向膜方向折叠。标记CH2II氨基末端的色氨酸残基似乎对保证细胞内门阀的关闭状态起着关键作用。为了研究这些结构特征是Cav2.2独有的还是在Cav2亚家族中保守的,研究人员试图解决人类Cav2.1和Cav2.3的结构。然而到目前为止,我们还无法获得合适的Cav 2.1样本用于冷冻电镜分析。

Cav2.3通道是由细胞外α2δ和胞质β亚基以及α1亚基组成的三元复合体,在皮层、海马、纹状体、杏仁核和花序间核中强烈表达。α1亚基Cav2.3a-f的六种不同剪接变体已经在不同的哺乳动物物种中被发现。Cav2.3功能障碍是发育性和癫痫性脑病(developmental and epileptic encephalopathy 69, DEE69)的主要原因,DEE69是一种严重的脑病,特征是难治性癫痫发作和神经发育障碍。Cav2.3缺陷小鼠表现出癫痫活动减少,疼痛反应改变,并对帕金森病相关神经退行性病变具有保护作用。因此,Cav2.3通道是治疗癫痫发作和神经障碍的潜在药物靶点。

人Cav2.3复合体的冷冻电镜结构(图源自Nature Communications )

与P/Q型和N型Cav通道不同,Cav2.3通道对ω-conotoxins的敏感性较低,ω-conotoxins是一组神经毒性肽,已被用于研究Cav2通道的生理功能。Cav2.3通道受到SNX-482的选择性抑制,SNX-482是一种41-aa肽毒素,来自于狼蛛宫腔巨蛛,具有抗接种活性。此外,Cav2.3通道表现出更快速的失活和更慢的失活恢复,这有助于其在神经元中特定的功能。

在这项研究中,研究人员报道了人类Cav2.3复合体的结构,总体分辨率为3.1 Å。结果表明,其结构与Cav2.2几乎相同,VSDII处于down状态,其余三个VSDs处于up状态。一个磷脂酰肌醇4,5-二磷酸(PIP2)分子结合到VSDII的界面和紧密封闭的孔隙域。

不仅如此,研究人员还确定了一个Cav2.3突变体的冷冻电镜结构,其中重复II中一个Cav2独特的胞质螺旋(Cav2-unique cytosolic helix in repeat II, 指定为CH2II螺旋)被删除。这个名为ΔCH2的突变体仍然保留了一个向下的VSDII,但PIP2是看不见的,胞质侧的近膜区域几乎不可见。对野生型和ΔCH2 Cav2.3的结构和电生理特征表明,CH2II螺旋通过收紧胞质近膜段稳定了通道的失活构象,而CH2II螺旋对锁定VSDII的下行状态并不必要。

总的来说,该研究旨在解决以下问题:

1)在冷冻电镜结构中,独特的CH2II螺旋是否是VSDII down状态的决定因素;

2) CH2II螺旋的功能和结构角色是什么?研究人员对人类Cav2.3的结构和电生理特征证实了CH2II螺旋在稳定通道失活构象方面的作用。在CH2II -删除的Cav2.3的结构中,PD是松闭的,但VSDII仍然是down的。整体构象不再与PIP2结合兼容。

因此,ΔCH2的结构说明了CH2II螺旋对于VSDII的down状态是不需要的。序列分析不能为VSDII的down状态的行列式提供直接的线索。未来的研究,如改造Cav1和Cav2嵌合体,然后进行系统性突变,可能揭示VSDII构象转换的决定因素。

https://www.nature.com/articles/s41467-022-35026-6

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