吴皓组破解NLRP3炎性小体激活组装机制

责编 | 兮

炎性小体是一种在固有免疫和疾病发生过程中具有重要作用的多蛋白复合体，在受到外源或者内源危险信号刺激后可以招募下游接头蛋白如ASC(Apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD)，进而调节caspase-1的活性，促进细胞因子如白介素1β（IL-1β）和白介素18（IL-18）的成熟。活化的caspase-1亦可以切割GSDMD导致细胞焦亡（pyroptosis），并促进成熟细胞因子的分泌。炎性小体包括NLRP1、NLRP3、NLRP6，NLRC4和AIM2等，其中NLRP3是炎症小体中最为重要也是最为神秘的成员。据报道，NLRP3炎性小体可以被尼日利亚菌素、尿酸结晶、淀粉样蛋白-β原纤维和外源ATP等多种刺激因子激活。NLRP3炎性小体在多种疾病发生过程中扮演着重要角色，包括家族周期性自身炎症反应、II型糖尿病、阿尔兹海默症、关节炎症，动脉粥样硬化症以及由新冠病毒引起的急性细胞因子风暴等。因此, NLRP3炎性小体可为作为许多疾病治疗靶点【1-5】。

NLRP3由PYD，FISNA（Fish-specific NACHT associated domain），NACHT和LRR多个结构域组成，其中NACHT结构域又包含：核苷酸结合结构域（Nucleotide-binding domain， NBD），螺旋结构域1（helical domain 1， HD1）、翼螺旋结构域（winged helical domain， WHD）和螺旋结构域2（helical domain 2， HD2）。有研究报道，定位于微管组织中心的 NEK7（丝氨酸/苏氨酸激酶）在有丝分裂间期中参与组装和激活NLRP3炎性小体。哈佛大学医学院和波士顿儿童医院的吴皓课题组一直致力于研究NLRP3炎性小体的激活机制，于2019年在Nature发表了人源NLRP3与NEK7复合物单体状态下的自抑制冷冻电镜结构【6】，并于2021年在Cell上发表了鼠源NLRP3十二聚体笼状自抑制状态的冷冻电镜结构【7】。随后，日本东京大学的Toshiyuki Shimizu和德国波恩大学的Matthias Geyer课题组分别在PNAS和Nature上报道了人源NLRP3十聚体状抑制状态【8】以及结合小分子抑制剂CRID3的冷冻电镜结构【9】。目前领域内的研究重点均致力于解析NLRP3的激活状态，试图阐明NLRP3炎性小体的激活机制。

，时长00:20

2022年11月28日，哈佛大学医学院和波士顿儿童医院吴皓课题组（第一作者为肖乐博士）在Nature上发表了题为Cryo-EM structures of the active NLRP3 inflammasome disk的研究文章（Article），解开了困扰领域多年的NLRP3炎性小体激活组装之谜。作者克服重重困难，通过体内和体外重组了由尼日利亚菌素激活的人源NLRP3-NEK7-ASC炎性小体，并采用ATP类似物ATPγS将重组的炎性小体稳定在激活状态，最后通过冷冻电镜解析了该复合物3.4 Å的高分辨率电镜结构。结构中包含了10个处于激活状态下的全长NLRP3，10个NEK7和10个ASC组成的炎性小体，共同组成了一个直径约为32nm的花环结构。其中NEK7与NLRP3的LRR结构域相互作用，值得注意的是，NEK7的结合位置与NLRP3笼状结构中LRR-LRR相互作用存在竞争关系，说明NEK7可以起到打开NLRP3自抑制笼状结构的作用。在激活状态下，寡聚的NLRP3的PYD结构域聚集并形成丝状结构，通过 PYD-PYD相互作用来招募下游的ASC并形成丝状结构，起始炎性小体的组装。

在结构中，研究者清晰地观察到ATP类似物ATPS与NBD和FISNA结构域相互作用。与NLRP3的抑制状态相比，在激活状态下，NACHT结构域在HD1与WHD连接处发生85°的刚性旋转，并暴露出新的作用界面（FISNA）导致NLRP3的寡聚和激活。这种激活方式与NLRC4的活化相似【10-12】，只是它们采用了完全不同的互作界面。值得注意的是，作者在结构中搭建了NLRP3完整的FISNA结构域。与抑制状态下的FISNA相比，Loop 1 和Helix 2 由无序变成有序，同时，Loop 2也发生了明显的构象变化。更为重要的是，FISNA的构象变化导致Loop1 和Loop2以及WHD的发卡结构域像拉链一样将临近的NLRP3分子组装到一起，并最终形成花环一样的寡聚体。花环的中心正好是NLRP3的PYD结构域，PYD结构域在花环中间聚拢并形成丝状结构招募下游的接头蛋白ASC。

最后，作者总结实验室和领域内前期的研究成果，推测了NLRP3炎性小体激活和组装的模型。在免疫细胞，比如巨噬细胞中，处于自抑制状态的NLRP3主要以单体或者寡聚体的笼状结构的形式存在于细胞质和反式高尔基体（TGN）上，在受到危险信号的刺激和结合ATP后，通过解聚的反式高尔基体囊泡转移到微管组织中心，并与NEK7结合从而打开自抑制笼状结构，最后通过招募下游的接头蛋白ASC完成炎性小体的组装。在激活过程中，NLRP3以预组装的花苞样结构在细胞中转移，最后由NEK7促发形成最终的激活形态，展现出了大自然对生命过程精美且细致的调控。

综上所述，该研究工作突破性的揭示了先天性免疫领域期盼已久的NLRP3炎性小体的激活组装机制，通过生物化学和生物物理学的研究手段展示了生物大分子通过精密且协调的组装来感应和抵御危险信号的分子机制，同时也为开发相关的药物提供了重要的理论和实验基础。

哈佛大学医学院吴皓教授为论文通讯作者，课题组博后Le Xiao(肖乐)为第一作者设计和完成了所有实验，Venkat Giri Magupalli（现为纽约血液中心助理教授） 提供了NLRP3和NEK7的表达质粒。

https://doi.org/10.1038/s41586-022-05570-8

制版人：十一

参考文献

1 Wang, L., Sharif, H., Vora, S. M., Zheng, Y. & Wu, H. Structures and functions of the inflammasome engine. Journal of Allergy and Clinical Immunology 147 (2021).

2 Swanson, K. V., Deng, M. & Ting, J. P.-Y. The NLRP3 inflammasome: molecular activation and regulation to therapeutics. Nature Reviews Immunology 19, 477-489 (2019).

3 Gaidt, M. M. & Hornung, V. The NLRP3 inflammasome renders cell death pro-inflammatory. Journal of molecular biology 430, 133-141 (2018).

4 Nozaki, K., Li, L. & Miao, E. A. Innate sensors trigger regulated cell death to combat intracellular infection. Annual Review of Immunology 40, 469-498 (2022).

5 Deets, K. A. & Vance, R. E. Inflammasomes and adaptive immune responses. Nature immunology 22, 412-422 (2021).

6 Sharif, H. et al. Structural mechanism for NEK7-licensed activation of NLRP3 inflammasome. Nature 570, 338-343 (2019).

7 Andreeva, L. et al. NLRP3 cages revealed by full-length mouse NLRP3 structure control pathway activation. Cell 184, 6299-6312. e6222 (2021).

8 Hochheiser, I. V. et al. Structure of the NLRP3 decamer bound to the cytokine release inhibitor CRID3. Nature 604, 184-189 (2022).

9 Ohto, U. et al. Structural basis for the oligomerization-mediated regulation of NLRP3 inflammasome activation. Proceedings of the National Academy of Sciences 119, e2121353119 (2022).

10 Zhang, L. et al. Cryo-EM structure of the activated NAIP2-NLRC4 inflammasome reveals nucleated polymerization. Science 350, 404-409 (2015).

11 Hu, Z. et al. Structural and biochemical basis for induced self-propagation of NLRC4. Science 350, 399-404 (2015).

12 Tenthorey, J. L. et al. The structural basis of flagellin detection by NAIP5: A strategy to limit pathogen immune evasion. Science 358, 888-893 (2017).