JACS：Pseudo-Aspidosperma生物碱合成中环加成反应的区域选择性

导读

近日，德国马克斯·普朗克化学生态学研究所Lorenzo Caputi和Sarah E. O’Connor团队在JACS上发表了题为“Recycling Upstream Redox Enzymes Expands the Regioselectivity of Cycloaddition in Pseudo-Aspidosperma Alkaloid Biosynthesis”的文章，报道了Dehydrosecodine如何受到氧化还原反应的影响，这反过来又促使具有替代区域选择性的环加成反应发生。通过将Dehydrosecodine与在上游途径中发挥作用的还原酶和氧化酶一起孵育，作者在体外和从上游中间体植物Nicotiana benthamiana重组获得罕见的假刺棘植物生物碱pseudo-tabersonine和pseudo-vincadifformine。此外，通过酶中间体结构表征和氘标记监测的方式提出了一种分步机制来解释pseudo-tabersonine骨架的形成。这一发现揭示了植物如何利用氧化还原酶对映选择性地从常见的前体中生成新的骨架。

正文

自然界利用环加成反应生成复杂的天然产物骨架。Dehydrosecodine是一种高活性的生物合成中间体，经过环加成可生成几种生物碱骨架，这些骨架是药理学上重要化合物如长春碱和伊宝加因的前体。一种生产生物碱的夹竹桃科的植物已经进化出了环化酶，可以催化一种较高活性的底物—Dehydrosecodine（1）的环加成反应，形成独特的生物碱骨架。作者和其他团队最近发现并表征了已知催化1环加成反应的酶：水甘草碱合成酶（TiTabS和CrTS）[催化(-)-水甘草碱（2）（抗癌药物长春碱和长春新碱的前体）的形成]；长春质碱合成酶（CrCS）[催化(+)-长春质碱（3）（长春花碱和长春新碱的前体）的形成]；和冠状碱合成酶（TiCorS）[它催化(-)-冠状定合酶（4）（抗成瘾剂伊波加因的前体）的形成]。TiTabS/CrTS和CrCS将1通过[4+2]环加成直接生成2和3，而TiCorS最初形成一种迄今尚未经过表征的不稳定中间体，然后被酶还原为4。原则上，底物1可以通过选择性环加成反应生成额外的骨架，但这些环化酶的广泛突变并没有导致酶产物谱的扩展。在这里，作者证明了环化酶TiCorS除了能生成4外，还能产生另一种pseudo-aspidosperma（Ψ-aspidosperma）型生物碱pseudo-tabersonine（Ψ-tabersonine）（5）（Fig. 1）。作者首先通过表征环化酶TiCorS产生的不稳定中间体来展示这种转化背后的机制基础。这种中间体可以被还原酶捕获生成4，也可以同时被还原酶和氧化酶捕获生成替代骨架5。借助氘标记技术研究了这些酶转化的机制。简而言之，1的化学反应性是由一个环化酶和一对能异构烯烃部分的氧化还原酶开发得到，这反过来促进了新的区域选择性环化反应。

Fig. 1: 夹竹桃科植物产生的dehydrosecodine（1）衍生生物碱（图片来源：J. Am. Chem. Soc.）

Tabernanthe iboga，一种通过酶TiTabS和TiCorS分别产生2和4的植物，也产生Ψ-aspidosperma型生物碱20-epi-ibophyllidine（Fig. 1）。为了确定T. iboga酶可以形成(+)-Ψ-tabersonine5，作者进行了体外偶合生化分析，其中不稳定的底物1由上游中间的茎乙酸马藤碱（6）经酶促反应生成。6首先被黄酮类precondylocarpine acetate synthase（PAS）氧化生成precondylocarpine acetate（7），然后被中链醇脱氢酶dihydroprecondylocarpine acetate合酶（DPAS）进行1,4-亚胺还原（Fig. 1）。Dihydroprecondylocarpine acetate（8）经过一个乙酰氧基的去除生成底物1，然后被一个环化酶捕获（Fig. 1）。

Fig. 2: Ψ-tabersonine（5）的生物合成（图片来源：J. Am. Chem. Soc.）

如图2a所示，作者观察到在某些条件下，5（而不是4）在使用TiCorS的分析中形成。因此，TiCorS似乎参与了4和5的生成。作者随后使用异质生产的蛋白质进行体外试验，以探测导致产物选择性切换的条件。结果发现：在pH 7.5时，在TiPAS1−3或CrPAS和TiDPAS1参与下，有利于形成5；在pH 7.5，在TiPAS1−3或CrPAS、TiDPAS1和TiTabS的参与下有利于生成2；而在pH 9.5时，在TiPAS1−3、TiDPAS2和TiCorS参与下有利于生成4（Fig. 2a）。之后，作者通过重建这里报道的生物合成酶，使其在Nicotiana benthamiana中产生2、5和9，进一步证实在体外获得的结果（Fig. 2b）。

此外，Dehydrosecodine的酸稳定异构体，angryline（1a），也可以分离和直接用于环化分析（Fig. 1）。1a必须在pH值高于8.5的情况下使用，在那里它将开环产生具有反应性的1。当1a代替6（pH值9.5）用于酶学测定时，作者可以观察到5、2、4和9的生成。值得注意的是，PAS（TiPAS1−3，CrPAS）和TiDPAS1对5和9的形成都是必需的，这表明Ψ-aspidosperma骨架的形成需要这些酶。然而，在4的生产过程中不需要PAS。

为了研究TiCorS的作用机制，作者通过优化初始不稳定产物的分离的条件，并使用NaBH4还原捕获该化合物16-carbomethoxycleavamine（10，1H NMR表征得到）。这表明TiCorS的初始环化产物为16-carbomethoxycleaviminium（11）。结合氘标记结果，当TiCorS产物被NaBD4还原时，这将导致11的1,2-还原反应的发生（Fig. 3）。值得注意的是，相关环化酶CrCS的晶体结构（70.8%基因序列一致性）显示，CS最初形成(+)-16-carbomethoxycleaviminium（11a），随后环化生成3，但与TiCorS不同的是，中间产物没有从活性位点释放出来。此外，3在酸性条件下可以开环形成11a。CD光谱显示TiCorS生成(−)-16-carbomethoxycleavamine（10），这是由CrCS生成的对映异构体。

Fig. 3: 16-carbomethoxycleavamine（10）的生成（图片来源：J. Am. Chem. Soc.）

利用对TiCorS环化产物的了解，作者提出了4的形成机制。从TiCorS活性位点释放后，11被TiDPAS2进行1,4-还原，进而促进第二次环化形成4（Fig. 4）。

Fig. 4: (−)-iboga 和 (+)-Ψ-aspidosperma生物碱的可能形成机制（图片来源：J. Am. Chem. Soc.）

对于5的形成机制：TiCorS将1环化到11，并将其从活性位点释放，在活性位点上，它被TiDPAS1通过1,2-还原反应还原至10，然后被PAS再氧化。生成的中间产物会自发环化形成5。9是由PAS氧化双还原(−)-16-dihydrocarbomethoxycleavamine（12）形成的（Fig. 4）。4和5之间的转化最终取决于DPAS催化1,4-还原反应还是1,2-还原反应。实验pH条件或蛋白质-蛋白质相互作用的变化可能是有利于1,2-还原反应而不是1,4-还原反应的原因。另外，一种尚未发现的在生理pH下产生4的还原酶可能决定着T. iboga中这种化合物的生物合成。

总结

Lorenzo Caputi和Sarah E. O’Connor团队展示了dehydrosecodine（1）如何通过氧化还原使具有区域选择性的环加成反应转化形成(−)-coronaridine（4）,(+)-Ψ-tabersonine（5），或(+)-Ψ-vincadifformine（9）。值得注意的是，这些氧化还原酶，DPAS和PAS，将stem madedine acetate（6）转化为dehydrosecodine（1），是从生物合成途径的上游引入的。因此，这一发现表明了植物如何在多个途径中实现对酶的循环利用。同时，如何控制这些上游酶的招募也是未来研究的重要方向。

文献详情：

Mohamed O. Kamileen, Matthew D. DeMars II, Benke Hong, Yoko Nakamura, Christian Paetz, Benjamin R. Lichman, Prashant D. Sonawane, Lorenzo Caputi * , Sarah E. O’Connor * . Recycling Upstream Redox Enzymes Expands the Regioselectivity of Cycloaddition in Pseudo-Aspidosperma Alkaloid Biosynthesis, J. Am. Chem. Soc. 2022. https://doi.org/10.1021/jacs.2c08107