Kevan M. Shokat团队在p53突变体共价抑制剂方面取得突破性进展

撰文丨Peng

肿瘤抑制蛋白（p53）是最早被发现的抑癌转录因子之一，TP53基因的突变被报道与大多数肿瘤的发生密切相关。与其他经典的抑癌因子的纯合缺失突变不同，TP53的突变往往表现为体细胞杂合错义突变，或者伴随着第17号染色体短臂以及第二个等位基因的缺失【1】。TP53等位基因的种系突变会导致Li-Fraumeni综合征，患这类疾病的患者癌症发生风险高达70-100%【2】。其错义突变主要发生在DNA结合结构域，突变使得p53蛋白与DNA的结合能力减弱【3】。已有的结构生物学研究揭示了p53 Y220C突变体的空间构象以及潜在的药物结合腔【4】，近年来也有研究团队针对这一结构特点研发出小分子药物PhiKan083，该药物特异性地结合至p53 Y220C的腔内，增加p53 Y220C与DNA的亲和性以及蛋白的热稳定性【5，6】。然而，PhiKan083并不能将p53 Y220C的热稳定性回补至野生型的水平，因此寻找一个更具临床潜力的小分子共价抑制剂是目前TP53突变临床治疗的当务之急。

2022年7月，来自加州大学旧金山分校的Kevan M. Shokat教授团队在Nature Chemical Biology杂志上分享了KRAS G12S突变体的特异性靶向共价抑制剂的研发成果。紧接着，Kevan M. Shokat团队在10月5日于Cancer Discovery期刊发表文章A small molecule reacts with the p53 somatic mutant Y220C to rescue wild-type thermal stability，延续了其在KRAS G12S突变体上的研发思路，进一步研发出p53 Y220C突变体的小分子共价抑制剂，该小分子药物能够特异性地与p53 Y220C突变体结合，使其热稳定性回补至野生型p53蛋白的水平，激活下游基因的表达。

研究人员针对p53 Y220C在空间上形成的口袋结构设计了13个小分子药物。研究人员首先以一个咔唑骨架为基础进行改造，将丙烯酰胺（KG1）或氯乙酰胺（KG2）亲电体连接至咔唑的氮原子上（如图所示），但小分子抑制剂KG1及KG2分别表现出热稳定性回补效果不佳和共价结合（标记）效率低的问题。因此研究人员对亲和试剂进行进一步筛选，并在小分子抑制剂的上增加氢键供体使得其与p53 Y220C 的D228碳骨架形成氢键连接，进一步设计出小分子KG3（乙醛）、KG4（甲胺）以及KG5（酰胺），其中KG5的标记效率高达到95.2 ± 0.5%，能够与p53 Y220C特异性地结合而不结合野生型p53蛋白。

研究人员发现KG5的标记效率有了明显提升，但是热稳定性回补效果仍不理想。为此，研究人员在对p53 Y220C-CL（C124S, C182S, C229S, C275S及 C277S突变后的p53 Y220C）-KG3结合复合体的晶体结构进行解析后，将可能影响结合稳定性的咔唑核心骨架更换为吲哚，经过这一设计得到的KG6（甲基丙烯酰胺），其热稳定性有所提高，但标记效率不足。在之后的尝试中，研究人员继续将不同的亲电体连接至吲哚的第四位骨架碳原子，改良得到标记效率和热稳定性均较高的KG10（苯基哌嗪）分子。研究人员再次将核心骨架从吲哚替换为氮杂吲哚（KG11）后，发现p53 Y220C的热稳定性得到进一步地提升。为了增强小分子与D228的相互作用，研究人员用哌啶（KG12）取代了哌嗪。最后，为了提高小分子的刚性，KG12 被进一步合成为四氢异喹啉（KG13）。至此，研究团队最终获得了共价标记率以及热稳定性回补率都达到最佳效果的小分子化合物KG13。

图 KG1-KG13 分子的结构、标记效率和热稳定性

随后，研究人员在H1299（p53 -/-）细胞中过表达p53 Y220C并验证KG13对p53 Y220C热稳定性的回补效果。结果表明，KG13处理后的p53 Y220C阳性细胞，其p53 Y220C突变体的蛋白热稳定性与野生型p53蛋白的热稳定性相类似。KG13处理后p53 Y220C蛋白对下游基因的表达激活也在稳定表达p53 Y220C的H1299（p53 -/-）细胞和U2OS（p53 +/+）细胞中被验证。最后，为了证明KG13的治疗潜力，研究人员利用KG13对病人来源的NUGC-4（p53 +/+）, NUGC-3（p53 Y220C/+）以及BxPC-3（p53 Y220C/-）细胞进行处理，并对下游蛋白的表达水平、细胞的生长抑制状况以及凋亡活性进行检测。结果表明，KG13处理后的细胞显示出p53 Y220C依赖的p53靶基因激活，细胞生长抑制和caspase活性增加等表型。

综上所述，该研究报道了第一个能够将p53突变体的热稳定性回补至野生型水平的Y220C特异性共价化合药物，为超过125,000名携带p53 Y220C突变的癌症患者提供了可能的治疗方案，同时也为Li-Fraumeni综合征患者的癌症预防治疗提供了的临床依据。研究人员称，在未来的研究中，他们将联合p53 Y220C稳定化合物与细胞周期抑制剂、促凋亡药物、治疗性低温等方案，致力于实现肿瘤治疗效果的最大化。

https://doi.org/10.1158/2159-8290.CD-22-0381

制版人：十一

参考文献

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2. McBride KA, Ballinger ML, Killick E, Kirk J, Tattersall MHN, Eeles RA, et al. LiFraumeni syndrome: Cancer risk assessment and clinical management.Nat Rev Clin5 Oncol. Nature Publishing Group; 2014;11:260–71.

3. Bullock AN, Henckel J, Fersht AR. Quantitative analysis of residual folding and DNA binding in mutant p53 core domain: Definition of mutant states for rescue in cancer therapy.Oncogene.2000;19:1245–56.

4. Joerger AC, Ang HC, Fersht AR. Structural basis for understanding oncogenic p53 mutations and designing rescue drugs.Proc Natl Acad Sci U S A.2006;103:15056–61.

5. Boeckler FM, Joerger AC, Jaggi G, Rutherford TJ, Veprintsev DB, Fersht AR. Targeted rescue of a destabilized mutant of p53 by an in silico screened drug.Proc Natl Acad Sci.2008;105:10360–5.

6. Bauer MR, Krämer A, Settanni G, Jones RN, Ni X, Khan Tareque R, et al. Targeting Cavity-Creating p53 Cancer Mutations with Small-Molecule Stabilizers: The Y220X Paradigm.ACS Chem Biol.2020;15:657–68.

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