范先群/雷鸣团队揭示糖异生关键酶别构激活机制

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丙酮酸羧化酶（PC）是催化丙酮酸的羧化生成草酰乙酸的关键酶，也是糖异生的第一步限速步骤。PC催化活性围绕其中心四聚（PT）结构域组织，包括两个连续反应：1）生物素羧化（BC）结构域催化Mg-ATP依赖性生物素羧化；2）羧基转位（CT）结构域将活化的羧基转移到丙酮酸以生成草酰乙酸。在这些连续的反应中，C-末端生物素羧基载体（BCCP）结构域必须在BC和CT活性位点之间的长距离穿梭（图1）。PC是重要的代谢调控酶，在胰岛素分泌、脂肪生成和神经递质生物合成中起着至关重要的作用，也是肥胖、糖尿病、病毒感染和癌症的重要靶点。

图1：丙酮酸羧化酶的功能和结构示意图

60年前，Utter and Keech等人发现乙酰辅酶A可以促进PC的酶活，却不参与反应（J Biol Chem, 1960 & 1963.）。值得注意的是，乙酰辅酶A别构调控PC的功能机制在代谢稳态中发挥着重要作用，包括维持血清电解质稳态（Cell, 2015）、癌症成纤维细胞激活（Nature Metabolism, 2021）、血糖调控等 (1964，Science; Nature, 2020)。在过去的20年里，大量研究致力于揭示乙酰辅酶A促进PC酶活性的分子机制。然而，之前的分子机制研究得出了相反的结论。比如，St Maurice课题组发现乙酰辅酶A导致了不对称的根瘤菌PC（RePC）的结构 (Science, 2007)，而在金黄色葡萄球菌PC（SaPC）中，乙酰辅酶A结合和不结合的PC分子的分子构象没有显著的区别 (Nature Structure & Molecular Biology, 2008; Structure, 2009)。总的来说，乙酰辅酶A如何变构激活PC缺乏机制上的见解，极大地阻碍了我们对这种必需酶的生理病理作用的深入理解。

2022年10月24日，上海交通大学医学院范先群院士和雷鸣教授团队在Molecular Cell上发表了文章Mechanistic insight into allosteric activation of human pyruvate carboxylase by acetyl-CoA，揭示了乙酰辅酶A如何别构激活丙酮酸羧化酶这一重要科学问题（图2）。研究发现，乙酰辅酶A可以稳定BC功能域形成二聚体，让其进入一个激活状态并促进一连串的级联反应，包括ATP水解、CT的酶活“口袋”开放，以及BCCP的长距离穿梭等。

首先，为了研究乙酰辅酶A诱导的PC构象变化，研究人员捕获了一系列乙酰辅酶A-PC复合物的结构（3.4-3.9 Å）。对这些结构的比较分析表明，BC结构域的稳定性与乙酰辅酶A结合之间存在显著的相关性。与PC中完全无序的BC结构域相反，在12.5μM乙酰辅酶A存在的情况下，BC二聚体的模糊电子密度出现在中心PT-CT-BCCP四聚体的一侧。当乙酰辅酶A浓度达到25μM时，BC二聚体在复合物中完全稳定，EM密度大大提高。有趣的是，在存在相应浓度的乙酰辅酶A的情况下，这种BC稳定性对乙酰辅酶A浓度的依赖性与PC酶活性完全一致。令人惊讶的是，即使乙酰辅酶A过量，只有一个BC二聚体完全稳定，尽管第二个非常不稳定的二聚体出现在PT-CT-BCCP四聚体的对侧（图2）。

图2：（Acetyl-CoA）-PC的电子密度图

为了研究乙酰辅酶A如何诱导PC复合物中的BC稳定，研究人员单独表达和纯化BC和PT-CT-BCCP作为单独的蛋白质，并在没有和存在乙酰辅酶A的情况下进行生化和结构分析。免疫沉淀显示，只有当IP样品中含有乙酰辅酶a时，BC和PT-CT-BCCP之间才存在明显的相互作用。凝胶过滤色谱实验一致表明，乙酰辅酶A可有效诱导BC和PT-CT-BCCP的共迁移，否则会出现在凝胶过滤曲线中的两个分离峰中。进一步的冷冻电镜分析表明，乙酰辅酶a还诱导BC-（PT-CT-BCCP）复合物中BC结构域的稳定，从而形成与天然PC复合物难以区分的构象。综上所述，这些结果表明乙酰辅酶A在BC和PT-CT-BCCP之间的稳定结合中起着中介作用，并有助于形成BC和PT-CT-BCCP更稳定的结构（图3）。这与之前的研究结果完全一致，即乙酰辅酶A在PC催化转化过程中降低了活化熵并诱导了更有序的热力学构型，这是以前的所有晶体结构研究无法解释的。

图3：Acetyl-CoA介导BC和PT-CT-BCCP形成更稳定的结构

与人类PC相比，来自乳酸李斯特菌（LiPC）的PC具有很高的内在活性，对乙酰辅酶A不敏感（PNAS, 2017）。LiPC活性是通过BC和PT结构域之间的直接静电相互作用建立的，这在人类PC中是不存在的，有助于维持LiPC的酶自我激活的构象。研究人员在人PC中引入了四个点突变（BC中的T72E和G73Y，PT中的E1047K和H1059S），以模拟LiPC中的BC-PT界面，并发现这种突变的人PC在没有乙酰辅酶A的情况下表现出显著增加的内在酶活性。值得注意的是，在葡萄膜黑色素瘤等细胞中，自我激活PC的表达显著抑制细胞生长。不仅如此，自我激活的PC的过度表达导致线粒体中草酰乙酸的显著增加和乙酰辅酶A的含量减少。这一结果表明，自我激活的PC活性的提高消耗了更多的丙酮酸来生产草酰乙酸，因此丙酮酸脱氢酶可以将较少的丙酮酸转化为乙酰辅酶A。伴随着乙酰辅酶A的减少，研究人员还观察到表达自我激活的PC的细胞中柠檬酸盐水平降低，这与线粒体中大多数乙酰辅酶A被消耗用于柠檬酸盐合成的事实一致。总之，这些结果表明，对乙酰辅酶A调节敏感的功能性PC对于葡萄膜黑色素瘤等细胞的代谢稳态和氧化呼吸至关重要（图4）。

图4：乙酰辅酶A对PC的调控影响细胞的代谢稳态和氧化呼吸

为了全面了解乙酰辅酶A变构如何调节PC，该团队研究了PC在两个连续反应中的构象变化。以时间分辨的方式建立了一个酶分析系统，它允许研究人员通过两个活性位点之间的远程通信来捕获过渡态（图5）。根据时间分辨的冷冻电镜的电子密度图，研究人员得出结论，乙酰辅酶A是PC反应中级联耦合事件的基本触发因素，其中乙酰辅酶A结合首先诱导稳定的BC二聚体，使ATP水解，导致BCCP从CT中心逃逸，随后在这两个反应中心之间长距离穿梭。

图5：时间分辨冷冻电镜捕捉（acetyl-CoA）-PC复合物的动态结构

研究人员为PC催化提供了一个完整的催化机制（图6）：在静止状态下，BC结构域采用高度动态构象，而所有BCCP都锁定在CT中心（状态1）。两个乙酰辅酶a分子的结合使PT-CT-BCCP四聚体核心一侧的BC二聚体稳定（状态2）。接下来，ATP选择性地结合到稳定的BC二聚体并导致B亚结构域阀门闭合，从而产生稳定的ATP水解囊（状态3）。然后，ATP水解驱动CT结构域的开放（状态4），使BCCP能够从CT中心逃逸（状态5）。然后，通过碳酸盐将BCCP和BC稳定在具有酶活性的结构中，以催化第一步反应-生物素羧化（状态6）。一旦生物素在BC中心碳化，BCCP-生物素-CO2-逃离BC反应中心（状态7），返回CT进行第二步反应-丙酮酸羧化（状态8）。一轮反应后，两个共轭乙酰辅酶A与PC四聚体分离，将PC复合物转化回失活基态，为下一个催化循环做好准备（状态1）。

图6：丙酮酸羧化酶的反应机制图

总之，该团队解开了乙酰辅酶A如何变构激活PC的长期谜团。鉴于PC的变构效应在多种疾病的代谢重编程中起着重要作用，PC-（乙酰辅酶A）复合物的结构信息在肥胖症、糖尿病、病毒感染和恶性肿瘤的拥有潜在治疗意义。

该论文的共同第一作者是上海交通大学医学院第九人民医院眼科的柴佩韦博士和上海交通大学医学院附属仁济医院的兰鹏飞研究员。雷鸣教授和范先群院士是本文的共同通讯作者。

https://doi.org/10.1016/j.molcel.2022.09.033

制版人：十一

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