摆脱PAM限制，Cas9突变体SpRY带来分子克隆新变革？

撰文 | 木兰之枻

分子克隆是众多实验室最基本也是最重要的实验技术，目前这一领域中最常用的是限制性内切酶系统。限制性内切酶须识别并结合特定的核苷酸序列方能发挥其酶切功能。现有内切酶可识别的核苷酸序列有限，极大的限制了分子克隆实验的灵活性。与限制性内切酶相比，CRISPR-Cas系统对靶位点的识别和酶切并不局限于特定的核苷酸序列，但受到PAM识别序列限制：如SpCas9仅能识别切割PAM序列为NGG的DNA位点。不过2020年Benjamin P. Kleinstiver实验室开发出的SpCas9突变体SpRY几乎完全摆脱了PAM困扰，其识别的PAM序列涵盖NRN和NYN（Y为C/T）（NRN > NYN），理论上可识别和切割任意位点【1】（Science | 摆脱PAM困扰—Cas9强势升级获得基因编辑新利器SpRY），因此在分子克隆实验中极具潜力。

2022年10月6日，来自哈佛医学院和麻省总医院的Benjamin P. Kleinstiver实验室在Nature Biotechnology杂志上发表了题为Precise DNA cleavage using CRISPR-SpRYgests的论文。文章证实SpCas9突变体SpRY在体外实验中同样摆脱了PAM限制，基本可实现任意位点的有效切割。之后通过优化gRNA的体外合成策略，研究者构建出一整套全新的分子克隆实验体系CRISPR-SpRYgests，为基因工程研究提供了新的解决方案。

本研究首先对SpCas9突变体SpRY在体外的PAM序列特异性和DNA切割活性进行了评估。研究首先对过表达野生型Cas9和SpRY的细胞裂解产物在20种不同gRNAs（PAM为NRN或NYN）靶位点处切割线性化质粒的能力进行分析，发现野生型Cas9仅在4/20种gRNAs靶位点处有较完全的酶切活性（>80%酶切效率），而SpRY在19/20种gRNAs靶位点处均有较完全的酶切活性。之后研究者还对野生型Cas9，SpG和SpRY在其它64种gRNAs（PAM为NNNN，其中第2/3/4位包含所有碱基组合）靶位点处的切割活性进行综合评估，发现Cas9和SpG的PAM序列特异性与已有研究吻合，而SpRY则在59/64种gRNAs处有较完全的酶切活性。进一步分析指出，SpRY的体外活性几乎不受PAM限制，不过PAM为NYN时，或sgRNA紧邻PAM的碱基为C时，其切割活性有一定程度降低。

随后研究者将SpRY系统（简称为SpRYgests）与Ago系统（限制性内切酶系统的潜在替代系统）进行比较。发现SpRYgests优势明显：商业化的TtAgo系统仅在1/5位点处（根据TtAgo系统要求设计选择的5处位点）有较完全的酶切活性，SpRYgests则在所有位点均有较完全的切割活性。而在上文提到的20种gRNAs靶位点处，TtAgo均无明显切割活性。

研究者还证实，SpRYgests在37 °C能有效切割纳克（ng）和微克（ug）级别的DNA模板。质粒构建实验中，SpRYgests与无缝克隆技术联用能有效简化分子克隆的实验流程并保证极高的正确率。研究还指出，SpRYgests的脱靶风险极低，且SpRYgests可用于饱和突变质粒文库的快速构建并有效降低成本。

SpRYgests的靶位点特异性依赖于gRNA的设计和合成。不过传统gRNA的体外合成步骤略显繁琐，为此研究者开发出新的一步法gRNA体外合成策略，可在4小时内完成gRNA的高效制备。优化后的gRNA合成策略让SpRYgests的实验流程可媲美传统的限制性内切酶系统。

总体而言，本研究以SpCas9突变体SpRY为基础开发的分子克隆体系SpRYgests几乎不受DNA序列的限制，展现出充分的灵活性和有效性。SpRYgests系统或将为分子克隆和基因工程研究带来新的变革。

原文链接

https://doi.org/10.1038/s41587-022-01492-y

制版人：十一

参考文献

1. Walton, R. T., Christie, K. A., Whittaker, M. N. & Kleinstiver, B. P. Unconstrained genome targeting with near-PAMless engineered CRISPR–Cas9 variants. Science 368, 290–296 (2020).

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