刘一凡/张经纬团队合作开发可调控体外微区室化策略

区室化现象于自然界中广泛存在。例如，细胞依靠渗透性可调控的细胞膜和各类细胞器来区室化生物大分子并调节其扩散，从而在保证与外界物质交换的同时能够进行复杂的生命活动。近年来，以油包水微液滴为代表的体外区室化体系在自底向上合成生物学和高通量生物技术等领域得到了广泛应用。然而，此类两相系统隔绝了区室间和区室-环境间的物质交换，限制了其在构建可持续的、复杂的体外合成生物学系统以及高通量反应中的应用潜力。例如，细胞无法在液滴中长期存活、生长，液滴中的生化反应体系无法进行液体置换等。

近日，上海科技大学与复旦大学联合团队在Advanced Science上发表了研究论文Permeability-Engineered Compartmentalization Enables In Vitro Reconstitution of Sustained Synthetic Biology Systems。在该工作中，作者提出了一种在纯水相环境中构建渗透性可调的微区室化系统的方法，并实验展示了该系统在构建可持续的合成生物学系统中的巨大优势。该微区室化系统为利用高通量微流控技术生成的多层微凝胶结构，胶囊的外层凝胶的孔径可按需调控，进而能够选择性调控生物大分子和微观颗粒（例如细菌和病毒）在微区室中的扩散。利用该系统，作者构建了区室化体外无细胞蛋白质合成体系，并通过调节区室渗透性，将转录-翻译活动在空间上隔离开来，使得反应效率提高的同时，限制在微区室中的基因和酶等重要生物大分子可以循环利用。在实验中，作者构建了约100,000个微区室结构，进行了多达5轮的重复表达，蛋白质产量达2.2 mg/mL。此外，作者构建了区室化活体细菌生物传感器。其在限制工程化活体细菌扩散到环境中的同时，也杜绝了外界竞争性微生物甚至噬菌体进入区室的可能，从而极大地提升了传感器在复杂环境中适应性，且不影响区室中工程细菌的增殖和传感。在复杂的河流淤泥环境中，微区室化的活体细菌传感器成功工作了高达48小时并准确检测了环境污染物的水平。作者认为该系统对合成生物学系统在真实环境中的应用提供可能性和便利性，例如绿色生物制造、环境传感和基于细菌的疾病治疗等。

生物区室化是自然长期进化的结果。在生命系统中，一个典型的微区室是细胞。区室化的细胞相较于开放性体系具有更低的熵，更高的效率，更高的稳定性。然而，细胞并不是完全与外界隔绝，其通过主动/被动的跨膜运输与外界环境进行物质交换，与周围细胞进行信号传递。多年来，研究人员一直致力于人工构建类细胞的区室化系统，以用来研究自然进化（例如，天然生物区室的形成）以及进行高通量独立的生化反应（例如，单细胞测序）。目前，被广泛运用的微区室系统为油包水微液滴。该系统的一个主要问题为近乎完全的隔离（溶液和生物分子无法交换），从而无法用于构建依赖物质交换的体外系统。比如，细胞无法在液滴中持续生长与增殖；复杂的多步生化反应无法进行必要的溶液交换、试剂添加等。本文中，作者描述了一种渗透性可调微区室化策略(Permeability-engineered Compartmentalization Strategy，简称PeCS)，并展示了在构建可持续的合成生物学反应体系中的显著优势（图 1）。作者利用高通量微流控技术生成了微米级多层水凝胶微区室。区室的外层凝胶结构不仅可用作简单的物理屏障，还可以实现类似分子筛的功能：通过调节外层凝胶的孔径大小，整个微区室的选择透过性得以实现按需调控，从而实现微区室内生的物大分子甚至细胞的选择性保留与释放。除渗透性可调之外，PeCS在区室结构、水凝胶材料构成和功能化方面也具有一定的灵活性。例如：包裹磁性纳米颗粒的微区室具有磁性，可通过生物实验室通用的磁性纯化的方式来便捷地对微区室进行处理。

选择透过性可调的微区室化策略示意图

由PeCS构建而成的体外合成生物学系统具有显著提高的持续性与稳定性。在一项实验中，作者构建了基于PeCS的区室化无细胞蛋白质表达系统。通过渗透性调节，该系统将参与转录活动的基因和酶限制在区室内，生成的转录本RNA分子则可以自由扩散出区室，在外界环境中进行翻译。因此，该系统实现了空间上的转录-翻译分隔，具有与真核生物细胞类似的特征。在另外一项实验中，作者基于PeCS构建了区室化活体细菌生物传感器，并以此为模型探究了PeCS在对基因工程化微生物（gene-modified microbe, GMM）的生物防护及适应性提升中的作用。于此，作者提出了观点：现有研究通常关注对GMM的生物防护，却忽略了GMM由于基因编程而在环境中的适应性缺失，这导致GMM在真实环境中的广泛应用存在困难。经验证，渗透性调控后的PeCS区室可以隔绝竞争性微生物甚至噬菌体，极大地提升了GMM在复杂真实环境中的适应性。目前，合作团队正在探究PeCS体系的在人体菌群等领域的应用。

本工作由上海科技大学物质科学与技术学院刘一凡课题组与复旦大学生命科学学院张经纬课题组合作完成。上海科技大学物质科学与技术学院2022届硕士研究生李璐瑶和助理研究员张蓉为本研究论文的共同一作。

上海科技大学物质科学与技术学院刘一凡课题组（高通量生物学实验室）致力于开发新的高通量生物技术和方法，为解析生命科学和医学中的复杂系统提供新的使能技术。目前，课题组正在招收博士后2-3名，欢迎生物医学工程、微生物、分子生物学、细胞生物学等背景的博士申请。

课题组相关信息请参考：

https://spst.shanghaitech.edu.cn/2018/1029/c2349a62494/page.htm

上海复旦大学生命科学学院张经纬课题组（单细胞表型组）致力于开发高通量平行智能液滴及新型生化反应，为合成生物学、细胞与免疫治疗治疗提供高分辨率高维度的单细胞解析与工程改造技术。目前，课题组与复旦大学遗传工程国家重点实验室正在招收单细胞表型组技术人员1名，欢迎生物医学工程、分子生物学、细胞生化学、工程背景的硕博士申请。

课题组相关信息请参考：

https://life.fudan.edu.cn/b3/0c/c28175a307980/page.htm

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/advs.202203652

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