基于酵母的生物传感器，可高通量检测微生物产生的四氢大麻酚

近年来，大众对大麻素的认知已经从一种非法药物转变成一种有前景的新处方药，该药物可用于治疗癫痫、多发性硬化症和慢性疼痛等疾病。其中，四氢大麻酚（THC）和大麻二酚（CBD）是两种最广泛研究且受临床批准的大麻素，通常仅存在于雌性植物花的毛状体中。目前这两种化合物的主要来源仍是大麻的提取物，这可能会浪费大部分植物生物质，且后期纯化也较为昂贵。

为了解决上述问题，研究人员开始寻求其他方法以增加大麻素的产量。其一是通过基因改造大麻以在植物的其他部位生产大麻素，并操纵代谢通量，从而提高所需化合物的产量；其二是利用合成生物学方法将从廉价原料生产大麻素的整条生物合成途径引入大肠杆菌和酵母中。近年来，合成生物学发展迅速，利用第二种方法大规模化生产大麻素对于产业界来说越来越具有吸引力，但该方法与传统植物来源竞争仍具有挑战性。

随着 DNA 合成成本的降低和基因组工程工具的改进，构建菌株突变体的能力大大超出了筛选和识别高生产者的能力，液相色谱-质谱（LC-MS）或可实现高生产者的高通量筛选，但使用 LC-MS 对于较小的研究团体和公司而言过于昂贵，这为代谢工程工作造成了瓶颈。

生物传感器作为一种廉价而强大的工具，可用于检测和量化各种代谢物。若将相应元件（如细胞表面受体）与报告基因（如绿色荧光蛋白）的表达联系起来，可以使用中等通量酶标仪间接测定生长代谢物。近日，Nature Communications 上报道了一篇以“Screening microbially produced Δ(9)-tetrahydrocannabinol using a yeast biosensor workflow”为题的文章。在这篇文章中，研究人员提出了一种基于酵母的生物传感器，可高通量检测微生物产生的四氢大麻酚（THC），降低筛选成本。

（来源：Nature Communications）

酵母生物传感器现已被开发用于检测微生物产生的血清素、褪黑激素和脂肪酸，也被用作工程化益生菌来检测和治疗小鼠炎症性肠病。基于之前报道的平台，研究人员在酵母中开发基于 GPCR 的生物传感器。GPCR 是一种哺乳动物 G 蛋白偶联受体，可检测范围广泛的配体和刺激物。

研究人员首先从已知对大麻素敏感的人类基因组中选择了一组 GPCR：CB1R 、CB2R、GPR18、GPR55 和 GPR119，它们在内源性大麻素系统（ECS）中发挥作用，调节多种生理功能。接着研究人员对五种人类 GPCR 的开放阅读框（ORF）进行密码子优化以在酵母中表达，并将它们克隆到受强组成型启动子控制的载体中。然后，研究人员将受体引入底盘菌株以及 12 个 Gɑ 蛋白文库中，并测试所有 60 株菌株，以计算 GFP（绿色荧光蛋白） 表达的倍数变化。结果所示，只有 CB2R 在添加配体时显示报告活性，且由于 CB2R 在标准条件下表现出高倍数变化，研究人员致力于利用这种受体进行生物传感。

▲图丨酵母中人大麻素反应性 G 蛋白偶联受体的功能偶联（来源：Nature Communications）

下一步，研究人员着手在酵母生产大麻素的背景下探索大麻素及其前体在 CB2R 生物传感器上的剂量反应曲线。

大麻素生产途径：在该途径中，直接前体橄榄酸 (OA) 和香叶基焦磷酸 (GPP) 结合形成大麻素网关前体大麻二酚酸 (CBGA)，然后 CBGA 通过各种合酶进行多样化，以产生大麻中常见的大麻素，包括大麻二酚酸 (CBDA)，(Δ9)-四氢大麻酚酸 (THCA) 和大麻二色酸 (CBCA)。这些分子通过热进行的非酶脱羧然后产生用于其治疗效果的更熟悉的大麻素形式，例如大麻二酚 (CBG)、大麻二酚 (CBD)、四氢大麻酚 (THC) 和大麻色素 (CBC)。

研究人员首先测试了 CB2R 生物传感器对 OA 和 GPP 的响应，接着用 CBGA 在一定浓度范围内进行了剂量反应实验，最后，用治疗相关的脱羧大麻素测试了 CB2R 生物传感器的剂量反应。结果显示出 CB2R 生物传感器能够在很宽的浓度范围内测量大麻素、大麻二酚、四氢大麻酚和大麻色素，且也表明 CBG 为弱激动剂，CBD 为中度拮抗剂，THC 和 CBC 为强激动剂，这与报道的 THC 和 CBD 在人类中的作用非常吻合。

为了确定 CB2R 生物传感器是否可用于筛选微生物产生的 THC，研究人员接下来着手从工程酵母细胞中进行检测。首先创建了一种产生 THCA 的酵母菌株（yZ135），该菌株可生产大麻素并能通过脱羧将 THCA 转化为 THC。一系列实验操作后发现，在 140°C 下，THCA 的纯样品在 30 分钟内脱羧成 THC。由此，确定了 CB2R 生物传感器工作流程孵育的最佳温度和时间。

▲图丨使用酵母 CB2R 生物传感器从微生物生产中筛选 THC 的工作流程（来源：Nature Communications）

在建立样品制备方案后，研究人员创建了一个基于 yZ135 的酵母菌株库，并使用 CB2R 生物传感器随机挑选了 109 株进行筛选，看看是否可以使用 CB2R 生物传感器测量生产中的相对差异，并确定任何具有改进的 THCA 生产的突变体。这为大部分位于生物传感器线性范围内的 108 个菌株产生了高质量数据，结果识别出比具有更高对照的信号 THCA 的 5 个菌株 (yS234) 。

然后团队通过 LC-MS 测量脱羧样品以直接量化相对 THC 量。直接比较 CB2R 生物传感器输出与相对 THC 量显示出中等相关性，表明该生物传感器有望在大规模筛选实验中为改进的 THCA 生产者丰富文库。

虽然 CB2R 生物传感器被证明可用于从微生物生产中筛选 THC，但该生物传感器有局限性。首先，研究人员无法将 THC 生物传感器响应与提取物中的其他大麻素分开，特别是 THCV 变体。为了改善这一点，可以进化 CB2R 受体以提高对 THC 的特异性。

研究人员还表示，期望未来看到更多基于 GPCR 的生物传感器被用作代谢工程的工具。GPCR 可以检测到的配体和刺激物的惊人多样性提供了一个在很大程度上仍未开发的生物传感元件来源。不过，挑战依然存在，如此项工作所示，并非所有哺乳动物 GPCR 都能在酵母中进行功能性表达，之前报道的那些在没有原始技术的情况下可能无法在其他环境中工作，需要开展工作以发现更普遍的原则，以改善 GPCR 在酵母中的表达、定位和偶联。