诺奖得主最新研究！开发基于Cas13的技术可用唾液快速检测新冠

快速核酸检测是传染病监测的核心。迄今为止，已有超过 600 万人死于 COVID-19，原因是其病原体SARS-CoV-2感染了超过 5 亿人。高无症状感染率、检测不足以及分子检测高度敏感的时间窗口狭窄等存在诸多挑战。因此，开发一种无需复杂仪器、快速诊断的检测技术至关重要。

2022年8月11日，加州大学伯克利分校 Jennifer Doudna（2020 年的诺贝尔化学奖得主之一）、David Savage 和 Patrick Hsu 共同通讯在 Nature Biomedical Engineering （IF=29）上发表了题为" Rapid detection of SARS-CoV-2 RNA in saliva via Cas13 "的研究性论文，该研究报告了一种用于快速 COVID-19 测试的方法及其在原型微流体设备中的实施。该检测被命名为 DISCOVER（用于冠状病毒酶报告的诊断），包括低成本的试剂进行免提取样品裂解、多重等温 RNA 扩增和 T7 转录，以及 Cas13 介导的淬灭荧光团裂解。

该设备由一个一次性使用的重力驱动微流控盒组成，该盒插入一个紧凑的仪器中，用于在 60 分钟内自动运行测定和读出荧光。DISCOVER 可以检测唾液中的严重急性呼吸综合征冠状病毒 2 (SARS-CoV-2)，灵敏度为 40 拷贝 μl–1，并且在使用从 63 个鼻拭子样本（33 个 SARS-CoV-2 阳性，循环阈值为 13-35）中提取的总 RNA 进行验证（针对定量 PCR）时，灵敏度为 94%，特异性为 100%。该设备正确识别了所有经过测试的临床唾液样本（13 个 SARS-CoV-2 样本中 10 个呈阳性，周期阈值为 23-31）。快速的即时核酸检测可能会拓宽分子诊断的使用范围。

另外，2022年8月11日，加利福尼亚州利弗莫尔桑迪亚国家实验室Joseph S Schoeniger及加州大学伯克利分校Jennifer A Doudna合作在Nucleic Acids Research （IF=19）在线发表题为“CRISPR-RNAa: targeted activation of translation using dCas13 fusions to translation initiation factors ”的研究论文，该研究使用 CRISPR-Cas13 作为翻译的可编程激活器。该研究通过将催化失活的 Cas13d 酶 dCasRx 与翻译起始因子 IF3 融合，开发了一种新的变体。该研究证明了 dCasRx-IF3 的表达能力比 dCasRx 高 21.3 倍，因为两者都针对大肠杆菌中编码红色荧光蛋白的 mRNA 的 5' 非翻译区的开始。翻译的激活依赖于位置，该研究发现 dCasRx-IF3 在靶向核糖体结合位点时会抑制翻译，而不是增强它。该研究提供的证据表明 dCasRx-IF3 靶向相对于 dCasRx 增强了 mRNA 稳定性，为这种新工具如何发挥作用以增强基因表达提供了机制见解。该研究还展示了天然 LacZ 2.6 倍的靶向上调，显示了 dCasRx-IF3 增强内源基因表达的能力。dCasRx-IF3 不需要额外的宿主修饰来影响基因表达。这项工作概述了一种新方法 CRISPR-RNAa，用于转录后控制翻译以激活基因表达。

快速、及时的核酸检测是控制疾病传播的强大检测基础设施的关键组成部分。实验室开发的测试，如定量聚合酶链反应 (qPCR)，在需要劳动密集型人员和设备基础设施的设施中进行样本采集、核酸提取、热循环和数据分析。样品运输和结果报告时间也极大地影响了集中测试的周转时间。与现场检测相结合的易于使用的微流控装置的开发，将能够增加快速分子检测的数量和获取途径。

迄今为止，已有超过 600 万人死于 COVID-19，原因是其病原体SARS-CoV-2感染了超过 5 亿人。高无症状感染率、检测不足以及分子检测高度敏感的时间窗口狭窄等诸多挑战可以通过广泛部署现场分子诊断来应对，例如在进入工作场所或教室时。社区监测测试也有巨大的潜力来增加临床工作流程，阳性病例通过转诊到更受限制的临床级测试供应来确认。替代采样方法和测试技术也有助于使诊断供应链多样化，因为临床测试的标准管道可能会受到 RNA 提取试剂盒或拭子短缺的限制。

用于快速和自动化分子诊断的DISCOVER微流体系统（图源自Nature Biomedical Engineering ）

因此，研究人员寻求开发一种不需要 RNA 提取或上呼吸道拭子的方法，并且可以集成到快速、自动化的微流体工作流程。基于 qPCR 的分析通常使用高温进行样品裂解。其他方法已利用离液剂、化学还原剂和 RNase 抑制剂。此外，据报道，唾液样本与鼻咽 (NP) 拭子的一致性为 97%。

基于CRISPR 的检测是一种有前途的核酸诊断新方法。这些方法依赖于 Cas13 或 Cas12 核酸酶的导向 RNA 依赖性激活，以分别诱导非特异性单链 RNA 或单链 DNA 核酸酶活性，以切割和释放报告分子。释放的报告子可以用荧光检测器进行定量测量，读出测试结果。基于 CRISPR 的检测具有高度特异性，但仅 Cas13 核酸酶就可能需要长达 2  小时才能达到诊断应用的阿摩尔级灵敏度。相比之下，环介导的等温扩增 (LAMP) 可在 20 分钟内以阿摩尔级检测限 (LOD) 进行高度灵敏的核酸扩增。然而，尽管 LAMP 的灵敏度和速度都很高，但这种等温方法往往容易出现非特异性扩增。

该研究报告了一种用于快速 COVID-19 测试的方法及其在原型微流体设备中的实施。该检测被命名为 DISCOVER（用于冠状病毒酶报告的诊断），包括低成本的试剂进行免提取样品裂解、多重等温 RNA 扩增和 T7 转录，以及 Cas13 介导的淬灭荧光团裂解。

该设备由一个一次性使用的重力驱动微流控盒组成，该盒插入一个紧凑的仪器中，用于在 60 分钟内自动运行测定和读出荧光。DISCOVER 可以检测唾液中的严重急性呼吸综合征冠状病毒 2 (SARS-CoV-2)，灵敏度为 40 拷贝 μl–1，并且在使用从 63 个鼻拭子样本（33 个 SARS-CoV-2 阳性，循环阈值为 13-35）中提取的总 RNA 进行验证（针对定量 PCR）时，灵敏度为 94%，特异性为 100%。该设备正确识别了所有经过测试的临床唾液样本（13 个 SARS-CoV-2 样本中 10 个呈阳性，周期阈值为 23-31）。快速的即时核酸检测可能会拓宽分子诊断的使用范围。

参考消息：

https://www.nature.com/articles/s41551-022-00917-y