Nature Commun｜王泽峰团队报道环形RNA中广泛存在驱动翻译的短序列元件

点评 ｜ 张金阳、赵方庆（中国科学院北京生命科学研究院）

环形RNA是一类在动植物中保守且丰度高的共价闭环RNA，在体内可通过不同机理发挥多种功能。环形RNA在传统上被认为是一种非编码RNA，在2014年，北卡罗来纳大学的王泽峰和汪洋首次报导了环形RNA在细胞内可通过非帽依赖的机理来翻译成蛋白。这种翻译通常需要IRES元件来驱动，但天然存在的IRES序列大多集中于病毒基因组中，真核生物转录组中已知的IRES元件十分罕见。该研究组后续工作中，发现RNA甲基化修饰m6A可以通过reader 蛋白来招募翻译起始因子，来驱动环形RNA的翻译 (Cell Research, 2017) 。然而某些没有m6A序列的负对照实验中，也发现了一些翻译的产物。暗示着还有其他的可驱动环形RNA翻译的未知序列。

2022年6月29日，中科院上海营养健康所的王泽峰研究团队在Nature Communications杂志在线发表了题为Pervasive translation of circular RNAs driven by short IRES-like elements的研究论文，报导了环形RNA翻译的新机理。该研究通过对随机序列的筛选，系统性鉴定出多个类IRES （内部核糖体进入位点） 元件来驱动环形RNA的翻译，并进一步通过分析质谱数据，鉴定出近千个能翻译的内源性环形RNA，其中一半可通过滚环翻译来合成大分子量的蛋白。此研究表明在人的转录组中存在普遍的非帽依赖性翻译 （cap-independent translation） 事件。

本研究开发了一种基于细胞的新筛选系统，可以无偏好地从随机序列中鉴定出能驱动环形RNA翻译的类IRES元件。且与线性mRNA相比，这些元件在环形RNA中显著富集，表明这些元件在进化过程中被环形RNA保留下来。由于类IRES元件在所有随机序列中占比约为2% （97/4096） ，概率上任何长于50个碱基的序列均可能包含一个类IRES元件，这暗示了多数环形RNA能利用类IRES元件进行翻译。此外，本研究还鉴定出数十个特异性识别这类类IRES元件的RNA结合蛋白，这些蛋白的结合可以驱动环形RNA翻译。通过质谱分析，本研究鉴定出上百个环形RNA编码的蛋白，其中一半环形RNA能进行滚环翻译。综上所述，本研究表明在环形RNA中存在大量驱动环形RNA翻译的类IRES元件，这暗示了翻译可能是环形RNA的主要功能之一，并说明非帽依赖性翻译远比目前所知的更普遍，也从另一个角度上支持了蛋白质组中的“暗物质”概念。

中科院上海营养与健康研究所王泽峰研究员为文章通讯作者，樊晓娟博士、杨赟博士、陈楚赟为文章共同第一作者。

文章链接：

https://doi.org/10.1038/s41467-022-31327-y

作者感言

王泽峰：

这是我职业经历中最难发表的一篇文章，先后经过了4年的投稿和审稿，不过个人以为这也是最近10年来我们实验室最重要的工作。最初我们发现的m6A 可以驱动环形RNA 翻译，引起了不少关注。但m6A的作用只是冰山一角，有些对照序列也可以对环形RNA的翻译有促进作用，这种意外使我们开始了这项研究。

这个工作的研究思路有很多个人特征在里面，比如用基于报告基因在细胞内对随机短序列进行无偏差筛选就是我在博后时第一个开发出来的方法，后来被我们和其他实验室不断应用。我个人喜欢无偏差的筛选，是因为它经常可以产生意想不到的结果。比如这个工作中，我们意外发现非帽依赖翻译所需要的条件很容易被满足，或者说，翻译起始是比较容易的，大量的非典型翻译会造成翻译“噪声”产生很多未知蛋白，类似于转录的“噪声”来产生大量非编码RNA。

这样离经叛道的想法在审稿中受到不断挑战。尤其是在环形RNA翻译领域最近有些不太可靠的工作的情况下，我们这种想法被非常严格地审视。文章2018年完成初稿并放在BioRxiv 上，在疫情前就经过了多轮投稿和审稿，其中一个杂志我们在二审时已经回答了当时实验条件下所有的疑问，但还是无法说服审稿人，结果有一年时间我们干脆就不再投了，而专门做对照实验。直到国外实验室用类似思路发了文章后，我们这种想法看着不再太离谱了。然后文章才转到了NC上修改后被接受。不过在严格审稿过程中也有新收获，其中最苛刻的一个审稿人，在minor point里面提出有两张胶非常像，怀疑是同一个胶的再曝光 (Fig. 3d, 大家可以看看来考眼力) 。结果我们把原图附上后，他就变得非常友好。另外一个审稿人要求我们比较环形RNA与mRNA的翻译效率以及体外制备的环形RNA是否依然有翻译活性，这些研究让我们进一步了解了环形RNA翻译的特点，也促使我们将环形RNA作为新一代mRNA 的应用进行转化。

专家点评

张金阳、赵方庆（中国科学院北京生命科学研究院）

近年研究表明，部分环形RNA分子可以通过内部核糖体进入位点 (IRES) 、m6A修饰位点等序列元件翻译短肽，具有一定的编码能力。然而，由于内源非帽依赖的翻译事件较为少见，同时效率较低，因此环形RNA是否在体内可以广泛地发挥编码功能仍未明确。

近日，中国科学院上海营养与健康研究所王泽峰研究员团队在Nature Communications杂志上发表了题为Pervasive translation of circular RNAs driven by short IRES-like elements的论文，对环形RNA的翻译机制进行了深入的探究。作者在前期工作中，意外发现了10nt的寡聚核苷酸可以起到类似IRES元件的作用，导致环形RNA的翻译起始。因此，该研究在此基础上进一步开发了高效的短IRES类序列的筛选方法， 鉴定到了97个可以显著促进环形RNA翻译的元件，并对其序列特征进行了系统地分析与验证。非常有意思的是，短IRES类序列在内源环形RNA具有显著富集，并可通过招募PABPC1、hnRNPU等反式作用因子，广泛促进内源环形RNA的翻译。

该研究进一步发现环形RNA具有特殊的滚环翻译能力，可以产生具有串联重复结构的肽段产物。通过整合大量蛋白组质谱数据，作者系统鉴定地到近千种内源翻译的环形RNA，并验证了滚环翻译产物的广泛存在。后续实验表明，环形RNA编码的蛋白具有特殊的序列信号，在体内会发生快速地降解，因此在此前的研究中，难以有效观测到环形RNA翻译产物的存在。由于大部分环形RNA具有非完整的ORF结构，因此环形RNA翻译产物在体内可能具有独特的折叠与聚集情况，或具有一定的免疫原性，其生物学功能仍需进一步的研究。

该研究首次发现了环形RNA所特有的短IRES类元件依赖的翻译途径，揭示了内源环形RNA的巨大翻译潜力，具有重要创新性和广泛应用价值。同时，该工作首次在体内验证了环形RNA特异的滚环翻译机制，为环形RNA的生物学功能提供了全新的研究方向。

近年来，环形RNA已经逐渐被广泛应用于基因编辑与疫苗开发等重要领域。与传统的mRNA分子相比，环形RNA可以具有相同的编码功能，并且由于其高稳定性以及不依赖表观修饰的优势，更加适合作为长效的蛋白翻译载体，可用于解决mRNA体内持续性不足的问题。因此，如何设计可高效翻译的环形RNA载体，已经成为了目前环形RNA研究中亟需解决的关键问题。

该工作中发现的短IRES类元件依赖的翻译机制为环形RNA的人工设计提供了全新的设计方向与理论依据，对开发基于环形RNA的新型疫苗或者癌症药物具有重要的指导意义。