沙倩倩等揭示女性随着年龄增长卵子质量下降的分子标记特征

近年来，随着女性受教育时间的延长、工作压力的增大，以及我国三胎政策的放开，生育年龄逐渐延后。根据第六次人口普查数据，我国女性平均生育年龄已达29.13岁，超过了专家建议的28岁前的黄金生育时段。其中，35岁以上高龄备孕者占比达到10%，而在这一群体中由于卵巢功能退行性障碍和卵子成熟障碍引起不育的比例尤其高。根据临床统计，40岁以上的女性进行辅助生殖的成功率只有30岁及以下年轻女性成功率的1/3。但目前，对卵子老化和卵巢功能退行性障碍的机制了解还非常有限，一些关键的科学问题没有得到解答，包括：根据怎样的量化指标可以评价多大年龄的卵子算是老龄卵子？女性年龄增长导致卵子老化的分子机制是什么？

包括组蛋白甲基化在内的表观遗传修饰在生殖细胞发育和受精卵重编程过程中扮演着非常重要的作用。其中，组蛋白H3第4位赖氨酸的三甲基化修饰（H3K4me3）由于在基因组中分布广泛、功能重要，近年来尤其引起本领域的关注【1】。以组蛋白甲基转移酶SETD1和DNA结合蛋白CXXC1为核心组成的蛋白复合体是卵母细胞中负责生成H3K4me3修饰的主要生物大分子【2-3】。近年来，包括H3K4me3在内的表观遗传修饰对细胞老化过程的影响尤其引起人们的关注。但是在人类卵母细胞中，组蛋白修饰水平与卵子老化的关系还未被报道。

广东省第二人民医院生殖中心生育力保护实验室沙倩倩团队与浙江大学生命科学研究院范衡宇团队，近期在Nature Communications上合作发表题为Dynamic mRNA degradome analyses indicate a role of histone H3K4 trimethylation in association with meiosis-coupled mRNA decay in oocyte aging的研究论文，首次在全转录组水平上系统分析了人类“母源-合子过渡”过程中母源mRNA的转录、翻译和降解能力与关键组蛋白修饰之间的相关性。

沙倩倩团队在对卵母细胞中组蛋白表观修饰的研究中，用分子标记发现了与临床数据相吻合的生育年龄拐点：随着妇女年龄的增加，卵母细胞中H3K4me3修饰水平明显降低，特别是在35岁以后出现急剧下降。同时，临床数据也显示，在35岁以前实施辅助生殖的女性，受孕成功率与年龄相关性不大，但年龄超过35岁以后，受孕率显著降低并随着年龄增长每况愈下，这一生育力变化曲线与组蛋白H3K4me3的变化曲线高度重合，提示该表观修饰可以作为与年龄相关的卵母细胞发育潜能的关键分子标志（图1A-B）。由于难以获得人卵母细胞用于实验研究，并且受到很多伦理因素的限制，研究团队转而利用小鼠这一哺乳动物生殖发育研究模型进行更深入的探索，并且发现在生育寿命接近尾声的雌性小鼠（14月龄，相当于人类40岁左右）卵母细胞中，H3K4me3水平也比青春期小鼠（4周龄，相当于人类18岁左右）低很多。研究团队在已发表的系列工作中发现，CXXC1-SETD1甲基转移酶复合体是维持卵母细胞中H3K4me3水平的关键蛋白质，因此在本研究中也继续研究了CXXC1与衰老过程中卵母细胞发育潜能的相关性。结果发现，CXXC1在卵母细胞中的表达水平与H3K4me3一样表现出岁年龄增长而降低。更直接的证据是，在卵母细胞中敲除Cxxc1基因，造成雌性小鼠不育，并且青春期小鼠就表现出生殖衰老特征，包括性周期失调、排卵数减少、卵母细胞细胞质中出现不规则的黑色颗粒、自由基水平升高、线粒体活性下降等。这些结果预示，随着年龄变化，CXXC1-SETD4组蛋白甲基转移酶活性下降，H3K4me3不能正常维持，影响细胞功能，可能是造成高龄备孕者卵子质量下降的关键因素。

图1：CXXC1和H3K4me3 水平与年龄之间的相关性分析。A-B：免疫荧光检测（A）并定量分析（B）随年龄变化人卵母细胞中H3K4me3的表达量变化。C-D：Cxxc1基因敲除的小鼠卵母细胞表现出提前老化的细胞生物学特征，包括活性氧自由基水平升高（C）和线粒体膜电位降低（D）。

研究团队进一步分析了老龄卵母细胞中CXXC1表达和H3K4me3修饰水平下降导致卵母细胞发育潜能降低的分子机制。临床上很多高龄妇女虽然能通过超数排卵得到少量的形态正常的卵母细胞，虽然能够完成“细胞核成熟”过程并成功受精，但是受精后早期胚胎发育率低下，经常因此受孕失败。推测可能是由于“细胞质成熟”过程存在尚不明确的缺陷引起。但目前对胞质成熟度缺少明确的评判指标，更无有效的预防和挽救措施。课题组近年来已发表的研究显示，母源mRNA降解缺陷可能是遗传和非遗传胞质成熟障碍的重要因素【4-5】。本研究进一步探讨了年龄与母源mRNA降解的相关性：收集了不同年龄段的人和小鼠卵母细胞，以及Cxxc1基因敲除卵母细胞，在减数分裂成熟前后进行了单细胞转录测序，结果显示，在卵母细胞成熟过程中，前期积累的大量母源mRNA首先发生翻译激活，然后在完成功能后发生降解，这是顺利完成“母源-合子过渡”并启动胚胎发育的重要前提。但是随着年龄增加，或Cxxc1缺失，卵母细胞虽然可以启动减数分裂成熟，但是mRNA降解能力减弱（图2A），这可能是造成临床中很多大龄患者的卵母细胞虽然完成了核成熟但是受精后发育潜能低下的重要原因。

经过更深一步的研究，研究团队解释了在老龄或缺失Cxxc1基因的小鼠卵母细胞中为什么会存在mRNA降解能力的缺陷。这是因为，母源mRNA清除所需关键蛋白质，如BTG4、CNOT6L、PABPN1L等，也是由卵胞质中储存的母源mRNA所编码，并在卵母细胞减数分裂成熟过程中发生翻译激活【6】。而老龄或Cxxc1敲除的卵母细胞中，这些关键母源mRNA的翻译激活和蛋白合成能力显著降低（图2B-C），从而不能有效启动后续的母源mRNA降解过程。而最近的另一篇研究论文也报道【7】，在老龄卵母细胞中特定母源转录本的翻译激活能力下降。这些独立的研究工作恰好相互印证、相互补充。

图2：人卵母细胞随年龄增长减数分裂成熟过程中母源mRNA翻译和降解能力降低。A：单细胞转录组分析显示老龄卵子在发育到减数第二次分裂中期（MII）时发生母源mRNA的异常积累；B-C：显微注射Btg4 mRNA 3’UTR reporter实验显示老龄小鼠卵母细胞在减数分裂成熟过程中mRNA翻译激活能力下降。

本研究延续了作者近年来以小鼠为模型进行的母源mRNA稳态调控机制研究，并且通过理论问题与临床现象密切结合的探索，得到以下创新性结果：1）通过对不同年龄人卵母细胞的表观修饰和转录组分析，结合CXXC1缺失和卵子老化的小鼠模型，提出卵母细胞中组蛋白修饰水平特别是H3K4me3与转录组变化之间的调控网络，并首次建立不同年龄段人卵母细胞减数分裂前后的母源mRNA降解数据库；2）虽然人和小鼠发育时程各不相同，但卵母细胞中都存在CXXC1-SETD1复合体维持组蛋白H3K4me3修饰和发育潜能的机制；3）年龄相关的母源mRNA翻译和降解效率是决定胚胎发育潜能的因素之一：并且细胞核中的组蛋白H3K4me3水平是调控母源mRNA正常翻译和降解的关键，从而维持卵母细胞核与卵胞质的同步成熟（图3）；4）在今后的辅助生殖临床实践中，可以把卵母细胞染色质上H3K4me3的水平和成熟卵子中母源mRNA降解程度，作为评价卵子老化程度的生化指标，从而能够有针对性地提出进一步的诊疗建议，不但有助于解决生殖发育生物学的关键理论问题，也对提高辅助生殖和胚胎生物技术的成功率具有现实指导意义。

图3：女性随着年龄增长卵子质量下降的分子标记特征：CXXC1介导的组蛋白修饰水平降低，导致母源mRNA翻译和降解缺陷。

广东省第二人民医院沙倩倩研究员和浙江大学生命科学研究院范衡宇教授为本文共同通讯作者。

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35680896/

制版人：十一

参考文献

1. Sha QQ, Zhang J, Fan HY. Function and regulation of histone H3 lysine-4 methylation during oocyte meiosis and maternal-to-zygotic transition.Front. Cell Dev. Biol,2020 8:597498. doi: 10.3389.

2. Yu C, Fan X, Sha QQ, Wang HH, Li BT, Dai XX, Shen L, Liu J, Wang L, Liu K, Tang F, Fan HY. CFP1 regulates histone H3K4 trimethylation and developmental potential in mouse oocytes.Cell Reports, 2017, 20(5):1161-1172.

3. Sha QQ, Dai XX, Jiang JC, Yu C, Jiang Y, Liu J, Ou XH, Zhang SY, Fan HY. CFP1 coordinates histone H3 lysine-4 trimethylation and meiotic cell cycle progression in mouse oocytes.Nature Communications, 2018 Aug 28;9(1):3477. doi: 10.1038

4. Sha QQ, Zheng W, Wu YW, Li S, Guo L, Zhang S, Lin G, Ou XH, Fan HY. Dynamics and clinical relevance of maternal mRNA clearance during the oocyte-to-embryo transition in humans.Nature Communications, 2020 Oct 1;11(1):4917.

5. Zheng W, Zhou Z, Sha QQ, Niu XL, Sun XX, Shi JZ, Zhao L, Zhang SP, Dai J, Cai SF , Meng F, Hu L, Gong F, Li XR, Fu J, Shi R, Lu GX, Chen BB, Fan HY, Wang L, Lin G, Sang Q. Homozygous Mutations in BTG4 Cause Zygotic Cleavage Failure and Female Infertility.American Journal of Human Genetics, 2020 Jul 2;107(1):24-33.

6. Jiang ZY, Fan HY. Five questions toward mRNA degradation in oocytes and preimplantation embryos: When, who, to whom, how, and why?Biology of Reproduction, 2022 Jan 29: ioac014. doi: 10.1093.

7. Del Llano E, Masek T, Gahurova L, Pospisek M, Koncicka M, Jindrova A, Jansova D, Iyyappan R, Roucova K, Bruce AW, Kubelka M, Susor A. Age-related differences in the translational landscape of mammalian oocytes.Aging Cell, 2020 Oct;19(10):e13231.

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