可在细菌中介导靶向蛋白降解的小分子适配器

撰文 | Enigma

蛋白质组学、化学生物学和高通量筛选技术的发展促进了药物发现的不断进步。然而，到目前为止，这些进展没有很好地体现在新型抗菌剂的开发上。考虑到过去50年里发现的抗生素数量很少，这种差异尤为明显。除了经济限制外，新型抗生素的开发还受限于细菌包膜渗透性低，以及在没有脱靶效应的情况下可被特异性抑制的微生物蛋白本身数量有限等因素。此外，病原体对现有药物产生耐药性的速度进一步加剧了寻找有效抗菌剂的难度。考虑到细菌流行病卷土重来的风险，采取新方法来防治感染迫在眉睫。

诱导消除靶蛋白是药物发现中新兴的概念，即采用合成化学物干扰各种降解途径，重定向溶酶体、自噬或泛素-蛋白酶体系统来靶向特定蛋白质。最著名的合成“降解物”是蛋白质水解靶向嵌合体 (PROTACs)，即一种具有双功能的小分子，包含E3泛素连接酶的结合头和与感兴趣的蛋白质 (POI) 结合的化合物。通过使E3连接酶和POI接近，PROTACs促进POI泛素化并随之被蛋白酶体降解。与经典抑制剂相比，蛋白质降解剂有许多优点。例如，由于它们的催化作用方式，它们表现出更高的功效。此外，它们几乎可以靶向任何细胞蛋白质，其模块化结构允许蛋白质配体被重新利用来构建降解物。但是，PROTAC技术目前仍局限于真核生物的泛素标记系统，尚未应用到细菌体内。

虽然泛素是真核细胞所特有的，但一些细菌利用类似的系统来靶向降解蛋白质。磷酸化精氨酸残基 (pArg) 可作为被ClpC:ClpP (ClpCP) 蛋白酶识别的降解信号，后者是一种准蛋白酶颗粒，存在于革兰氏阳性菌和分枝杆菌中，对微生物蛋白质量控制、逆境耐受性和致病性至关重要。ClpC通过充当ATP驱动的解折叠酶来选择特定的客户蛋白并将其转位到ClpP形成的蛋白酶腔中，从而实现其质量控制功能。ClpC原聚体包含一个氨基端结构域 (ClpCNTD)，两个AAA (与不同细胞活性相关的ATP酶) 结构域 (称为D1和D2)，以及插入D1的螺旋状结构域 (M结构域)。与识别复杂多泛素信号的真核蛋白酶体相比，ClpCP识别的降解信号要简单得多:一个附着在客户蛋白的精氨酸残基上的普通磷酸基。

2022年6月3日，德国杜伊斯堡大学Markus Kaiser和奥地利维也纳生物中心Tim Clausen课题组合作，在Cell上发表了题为BacPROTACs mediate targeted protein degradation in bacteria的研究论文。他们研究了ClpCP降解机制是否可以被小分子直接重编程，发现一种双功能适配器可以将新底物连接到ClpCNTD受体结构域，使其发生降解。他们证明这种“BacPROTACs”在体内具有活性，可以诱导靶向蛋白的有效降解。

为了实现ClpC介导的蛋白降解，作者设计了由POI配体、化学连接体和ClpCNTD锚定物组成的BacPROTACs。该锚定物起初由模拟细菌降解标记的多肽pArg衍生物组成。为了测试新底物的靶向性，作者采用链霉亲和素单体 (mSA) 作为模型蛋白，将pArg模块与生物素（mSA高亲和力配体）偶联（BacPROTAC-1）。为了分析这种拉近的空间距离是否足以触发mSA降解，作者在体外重组枯草芽孢杆菌ClpCP蛋白酶，并监测不同BacPROTAC浓度下mSA的降解情况，发现BacPROTAC浓度为100 μM时可诱导选择性的mSA降解，表明细菌的CIpCP可通过这种包含pArg的化学适配器进行调控。只有在浓度高于单体间测量的亲和性的情况下才能观察到有效的降解。除了BacPROTAC的亲和力外，招募的新底物的结构特征也显著影响降解效率。

作者对ClpC与BacPROTAC-1和mSA-Kre融合蛋白的复合体进行了结构分析，以阐明pArg标记的底物激活ClpC重构的机理。该重组三元复合体的冷冻电镜结构提供了一个ClpC在展开连有BacPROTAC的底物过程中的快照。ClpC 24-mer的结构表明，pArg标记不仅作为一个降解信号，而且介导高阶低聚物的形成和ClpC的激活。含有pArg片段的BacPROTAC触发了这种重塑机制，因此它不仅作为化学适配器，而且还作为ClpCP蛋白酶的激活剂。

为了检验这种降解物的治疗潜力，作者将该方法转移到分枝杆菌上，后者是最广泛传播和危险的人类病原体之一。为克服基于pArg的PROTAC药代动力学特征较差和磷胍基团的化学不稳定性的缺点，他们采用CymA类环肽 (sCym-1或dCymM) 取代pArg加入这种化学适配器中，允许不同的连接点产生有效的选择性降解物。结果表明，BacPROTACs是一种多功能的分子工具，可用于各种蛋白质底物，并允许整合不同头部基团和化学连接子。此外，他们还发现，基于Cym的BacPROTACs可以重编程ClpC1P1P2来诱导分枝杆菌中POI的降解。此外，他们的数据显示，尽管存在化学修饰，Cym仍保持其通过分枝杆菌细胞包膜的能力，为BacPROTAC的开发提供了一个有吸引力的工具。最后，作者在分枝杆菌中实现了靶标蛋白的诱导降解。

总的来说，该工作开发了小分子适配器BacPROTACs，将靶向蛋白质降解技术扩展到细菌。除了指导抗生素的药物发现，BacPROTAC技术还提出了一个通用的研究工具，使细菌蛋白质的诱导降解。

https://doi.org/10.1016/j.cell.2022.05.009

制版人：十一

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