人黏连蛋白介导的环指导DNA复制起点定位

撰文 | 言笑

人类细胞间期的基因组折叠成拓扑关联结构域（topologically associating domains, TADs）。在第一代Hi-C和5C数据中，TADs被定义为超大规模的、自相互作用的染色质片段，其中DNA序列在区域内的接触频率大大高于区域间的接触频率【1-3】。过去十年中，分子和计算领域的进步实现了超高分辨率基因组折叠图谱的绘制，信噪比得到了显著改善。通过这些技术发现了A/B区室【4】，TADs中的嵌套subTADs【5】，指示长范围（long-range）环相互作用的点状结构【4】，以及指示环挤压的条带（stripe）【6】。根据详细的（fine-grained）结构特征对Hi-C图中的TADs/subTADs亚型进行分类是极具挑战性的。明确定义TADs/subTADs的结构类别，反过来将有助于仔细分析各个边界的分子组成、组织原则以及基因组功能范围内独特的因果关系。

DNA复制通过一系列错综复杂的分子事件发生，是基因组稳定性的基础。目前，尚不清楚复制起点（origin）的位置是如何在人类基因组中确定的。2022年6月8日，来自美国宾夕法尼亚大学的Jennifer E. Phillips-Cremins团队在Nature杂志上在线发表了题为Cohesin-mediated loop anchors confine the locations of human replication origins的文章。研究人员剖析了TADs、subTADs和环（loops）在复制起始区（initiation zones, IZs）定位中的作用，并提出了一个模型：黏连蛋白介导的环挤压（cohesin-mediated loop extrusion）及其在遗传编码的TAD和subTAD边界处的停顿是决定S期复制起点位置的重要因素。

作者开发了一种高分辨率Repli-seq方法，允许以50-kb分辨率鉴定基因组中IZs的位置。将不同阶段S期的IZs基因组位置与来自人类胚胎干细胞（H1）的高分辨率Hi-C数据进行比较：高效率early-S-phase IZs与一侧或两侧由corner-dot TADs/subTADs划分的强绝缘边界共定位（图1a）；相反，在S期后期起始复制的低效率IZs与没有corner-dot的TADs/subTADs之间的边界共定位（图1a）。作者因此将边界分为三组：双点边界——两侧相邻的corner-dot TADs/subTADs；单点边界——仅一侧的corner-dot TADs/subTADs，另一侧无点；无点边界——两侧相邻的无点TADs/subTADs。由于双点和单点边界表现出相似的IZ定位模式，作者组合为点边界。Cohesin对TADs/subTADs的形成至关重要。作者观察到，与早期IZs重叠的点边界处的共同结合CTCF和cohesion位点的密度更高。与early-S-phase IZs共定位的边界表现出由CTCF和cohesin共结合motifs占用增加。

图1. 高效IZs特异性地定位于角点TAD/subTAD边界

最近的报告发现，聚合的CTCF motifs锚定了由cohesin-mediated loop extrusion形成的long-range loop相互作用。作者观察到，大多数点边界都由两个或多个CTCF+cohesin-binding motifs构成，这些motif以聚合或发散方向排列（图1c）。当点边界与早期复制IZs共定位时，这个分子特征将会进一步强化。相反，几乎所有的无点边界仅包含一个或没有CTCF+cohesion-bound motifs（图1c）。无点边界与晚期IZs共定位，通常被一个CTCF motif锚定（图1c）。因此，作者将点和无点边界进一步分层：复杂方向的具有CTCF+cohesion-binding motifs（classes 1和4）、串联+单向motif（classes 2和5）、无结合motif（classes 3和6）（图1d）。

为了了解cohesin和TAD/subTAD结构完整性对S期中起点的定位是否是必要的，作者在cohesin亚基RAD21降解的HCT116细胞中检测了全基因组折叠破坏后的IZs。在野生型HCT116细胞中鉴定出与人类ES细胞相同的点和无点TADs/subTADs以及边界类别。敲低cohesin后，几乎所有的点和无点边界都被破坏了。作者在野生型和cohesin敲低HCT116细胞中获得了高分辨率16-fraction Repli-seq数据，以及单分子光学复制图谱（optical replication mapping, ORM）数据。16-fraction Repli-seq数据在野生型HCT116细胞中表现出高效/早期IZs在点边界的特异性富集，低效率、晚期IZs在弱无点边界处富集。通过分析单分子ORM数据，作者在class 1边界处检测到起点初始化的富集。消除cohesin介导的边界后，class 1边界处的高效early-S-phase IZs受到严重破坏。在cohesin敲低后，位于无点边界处的低效率IZs在S期末转向复制。

如果cohesin无法卸载，G1期中停留在复杂CTCF边界上的cohesin分子将会增加，进而产生新的long-range loops，可能会使S期高效起点数量增加或它们的基因组位置变窄。作者在G1期WAPL降解的HCT116细胞中通过16-fraction Repli-seq检测了S期IZs的基因组位置。WAPL敲低后的gain-of-looping表型显著性地发生在具有复杂方向的CTCF motif点边界处。在class 1边界，WAPL敲低之后早期IZs变窄。在WAPL敲低的条件下，IZs的收紧和优化都发生在相同的边界处。这些实验结果进一步支持一个模型：间期中的cohesin-mediated loop extrusion可以确定性地告知S期中活化起点的位置。

最后，作者试图了解特定的边界是否是调节IZ firing的充要条件。作者在基因组中删除了80-kb，该部分包含超过10个复杂取向的CTCF+cohesion-binding位点，锚定了一个long-range染色质环，该环将晚期复制定时域与早期复制时间域分开。删除80-kb后，从早期到晚期复制时间发生局部延迟，表明在特定的早期 IZ的复制可以在边界消除后转移至S期后期。随后，作者引入了异位边界，发现在异位边界处晚期复制转变为早期复制，表明引入异位边界足以诱导复制起始的变化。

了解人类基因组的结构-功能关系仍然是人类遗传学家和染色质生物学家面临的主要挑战。该研究通过表示loop的角点和CTCF基序的方向对TADs和subTADs进行分层，确定了TADs/subTADs的不同结构类别与DNA复制之间的功能联系：（1）高效率的早期复制IZs定位在相邻corner-dot TADs之间的边界；相反，低效率IZs定位在较弱的无点边界。（2）在G1期消除cohesin-mediated loop extrusion将扰乱高效率IZs定位；敲低WAPL后，将会在相同边界上获得long-range loop并缩小IZs定位；删除或插入特定边界会导致局部复制时间偏移。

DNA复制的启动涉及两个相互排斥的步骤。第一步，获得起点许可，开始于细胞分裂末期，加载两个拷贝的迷你染色体维持复合物（MCM2-7）。MCM2-7最初以非活性形式在人类基因组的数万个位点过量加载，作为双六聚体，环绕双链DNA。第二步，起点的激活，发生在S期开始时。起点激活涉及的机制既能阻止MCM的进一步加载，又能招募多个额外的因子来启动双螺旋的解旋和 DNA 合成。在哺乳动物系统中，如何控制和选择MCM-bound、licensed origins子集，使其在S期激活，仍然是一个谜团。该研究提出了一个模型，由复杂方向CTCF+cohesion-binding位点标记的点边界上的cohesin-mediated loop extrusion和停留是高效复制起点定位所必需的（图2）。

图2. DNA复制起始模型

https://doi.org/10.1038/s41586-022-04803-0

制版人：十一

参考文献

1. Dixon, J. R. et al. Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions.Nature485, 376-380 (2012).

2. Nora, E. P. et al. Spatial partitioning of the regulatory landscape of the X-inactivation centre.Nature485, 381-385 (2012).

3. Sexton, T. et al. Three-dimensional folding and functional organization principles of the Drosophila genome.Cell148, 458-472 (2012).

4. Rao, S. S. et al. A 3D map of the human genome at kilobase resolution reveals principles of chromatin looping.Cell159, 1665-1680 (2014).

5. Phillips-Cremins, J. E. et al. Architectural protein subclasses shape 3D organization of genomes during lineage commitment.Cell153, 1281-1295 (2013).

6. Vian, L. et al. The energetics and physiological impact of cohesin extrusion.Cell173, 1165-1178 (2018).

7. Bellush, J. M. & Whitehouse, I. DNA replication through a chromatin environment.Philos. Trans. R. Soc.B 372, 20160287 (2017).

8. Mechali, M. Eukaryotic DNA replication origins: many choices for appropriate answers.Nat. Rev. Mol. Cell Biol.11, 728-738 (2010).

9. Wang, W. et al. Genome-wide mapping of human DNA replication by optical replication mapping supports a stochastic model of eukaryotic replication.Mol. Cell81, 2975-2988 (2021).

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