新策略！四川大学姚少华团队大大提高先导编辑系统的效率和准确性

由 Cas9 切口酶和逆转录酶组成的 先导编辑器能够对小 DNA 片段进行有针对性的精确编辑，包括所有 12 种碱基替换、插入和缺失，而无需双链断裂或供体模板。当前优化的先导编辑策略 (PE3) 使用两个引导 RNA 来指导先导编辑器的性能。一种携带间隔序列和模板序列 (pegRNA) 的引导 RNA 引导先导编辑器产生 ssDNA 断裂和随后的延伸，另一种在互补链中产生切口。

2022年6月10日，四川大学姚少华团队在Nucleic Acids Research （IF=17）在线发表题为“Bi-PE: bi-directional priming improves CRISPR/Cas9 prime editing in mammalian cells ”的研究论文，该研究证明了将 nick sgRNA 定位在 pegRNA 的模板序列附近有助于靶向大片段缺失，并且将两个引导 RNA 工程化为 pegRNA 以实现双向启动编辑 (Bi-PE) 进一步将效率提高多达 16倍，将编辑产品的准确性提高了 60 倍。

此外，该研究发现 Bi-PE 策略还提高了多个碱基同时转化的效率，但与 PE3 相比，单碱基转化效率没有提高。综上所述，Bi-PE策略扩大了编辑范围，提高了先导编辑系统的效率和准确性，具有广泛的潜在应用前景。

成簇的规则间隔的短回文重复相关 (CRISPR-Cas) 系统是一种免疫系统，经常被细菌和古细菌用来防止外来噬菌体和质粒的感染。 CRISPR 系统，尤其是 Cas9 系统，很容易重新编程以用于基因组编辑，为基础生物医学研究和临床转化提供强大的工具。最近，先导编辑 (PE) 工具的发现能够以精确且不可逆的方式进行有针对性的碱基转换或引入小规模的遗传改变，同时不会导致强大的 DSB，使得纠正遗传病中的小块遗传变变得切实可行。

尽管在广泛的应用中显示出巨大的潜力，但目前的 PE 系统效率较低，尤其是在基因组中进行大量插入和删除时，这是其应用的最大障碍之一。目前，先导编辑器系统的优化版本PE3由四个部分组成：（i）切割DNA的Cas9核酸内切酶；(ii) 先导编辑指导 RNA (pegRNA)，其将先导编辑引导至 DNA 靶标以产生 ssDNA 断裂并为带切口的 DNA 提供先导结合序列 (PBS) 和 RT 模板；(iii) 从 pegRNA 模板转录 DNA 的逆转录酶 (RT)，以及(iv)引导编辑器对未编辑链进行切口的切口 sgRNA。

在 HA 区域附近定位 nick sgRNA 可改善 PE3 介导的大 DNA 片段缺失（图源自Nucleic Acids Research ）

这四个部分的协同作用在靶位点周围产生两个 DNA 损伤，编辑链中的单链 DNA 断裂，其 3' 末端通过 RT 延伸，非编辑链中的纯 ssDNA 断裂。编辑链的 3' 末端延伸由 pegRNA 模板化，该 pegRNA 设计为包含 PBS、编辑和与待编辑位点下游的 DNA 序列同源的同源臂 (HA)。通过 DNA 修复或通过 DNA 复制机制固定这些 DNA 损伤导致 3' 末端延伸整合到基因组中。

尽管详细的固定过程仍然未知，但原始编辑的结果表明，携带编辑的新逆转录 ssDNA 必须替换原始序列，这类似于同源定向双链断裂 (DSB) 修复过程中 ssDNA 入侵和瓣切割的过程。在哺乳动物细胞中，入侵是一个复杂的过程，需要多种因子作为结合伙伴来稳定入侵 ssDNA 的末端或作为交换因子来指导同源性搜索。由于许多这些因素，如 RPA、Rad51 和 BRCA1，是由 DNA 断裂募集的，研究人员假设将 PE 系统的 nick sgRNA 定位在 HA 附近将有助于其同源性搜索和随后的入侵，从而改善大片段缺失。

对未编辑链中 ssDNA 断裂位置的系统检查表明，只有 HA 附近的断裂能够诱导可检测到的大 DNA 片段的靶向缺失，范围从数百到数千个碱基对。重要的是，当将 nick sgRNA 工程化为第二个 pegRNA 以实现双向启动编辑 (Bi-PE) 时，大片段删除的效率进一步提高。Bi-PE 策略在多重碱基转换、片段替换和在同一等位基因中同时插入配对 LoxP 位点方面也很有效。重要的是，与 PE3 相比，Bi-PE 策略的编辑产品包含的不需要的插入缺失要少得多。因此，Bi-PE策略扩大了编辑范围，提高了先导编辑系统的效率和准确性。

参考消息：

https://academic.oup.com/nar/advance-article/doi/10.1093/nar/gkac506/6605314