NAR | 中山大学李剑峰课题组开发植物碱基编辑工具箱及新用途

责编 | 王一

农作物的很多农艺性状由特定基因的单核苷酸差异（SNV）决定。单碱基的转换无论对于植物基因功能研究还是分子设计育种都具有重要意义。CRISPR技术衍生的单碱基编辑工具（base editor，BE）能够高效实现基因组中靶序列编辑活性窗口内C>T或A>G的转变（前者对应胞嘧啶碱基编辑器或CBE，后者对应腺嘌呤碱基编辑器或ABE）。CBE和ABE分别由胞嘧啶或腺嘌呤脱氨酶与nCas9切口酶融合而成。构成CBE的胞嘧啶脱氨酶存在许多天然存在或人工进化的同工酶。包含不同胞嘧啶脱氨酶同工酶的CBE由于其内在催化性质的差异，会对同一靶序列表现出不同的编辑活性窗口位置和窗口宽度。同时，包含不同nCas9来源的CBE由于其PAM序列要求的差异，可适配不同的靶序列。因此，碱基编辑工具的多样化有利于满足对不同基因组中任意靶序列的碱基编辑需求。

近日，中山大学生命科学学院李剑峰课题组在Nucleic Acids Research发表了题为A cytosine base editor toolkit with varying activity windows and target scopes for versatile gene manipulation in plants的研究论文，报道了由多种包含人源胞嘧啶脱氨酶变体AID10的CBE和CBE-ABE双碱基编辑器所组成的植物碱基编辑工具箱，并展示了利用该工具箱研究蛋白编码基因和非编码基因功能的新策略。

作者首先通过将AID10胞嘧啶脱氨酶置于常规nCas9（nSpCas9，PAM为NGG）的N端、C端或两端，获得三种编辑活性窗口位置和窗口宽度不同的CBE：AID10-nCas9-UGI的编辑活性窗口位于PAM远端且较宽，nCas9-AID10-UGI的窗口位于PAM近端且较窄，而AID10-nCas9-AID10-UGI的窗口范围为前两者的叠加（尿嘧啶糖化酶抑制剂UGI能够促进C>T的转变）。通过用nSpCas9-NG（PAM为NG）、nSaCas9（PAM为NNGRRT）或nSaCas9-KKH（PAM为NNNRRT）替代AID10-nSpCas9-UGI中的nSpCas9，作者增加了宽活性窗口CBE的靶序列选择范围，以进一步满足对基因组中不同靶序列的编辑需求。有趣的是，通过对比AID10-nSpCas9-UGI和AID10-nSaCas9-UGI对基因组中重叠靶序列的编辑效率，发现两种CBE对基因组的同一区域可能具有迥异的编辑效率，提示构建多样化的CBE工具箱十分必要。受AID10-nCas9-AID10-UGI启发，作者还通过引入ABE8e腺嘌呤脱氨酶，开发了ABE8e-nCas9-AID10-UGI和AID10-ABE8e-nCas9-UGI等多种CBE-ABE双碱基编辑器，能够对靶序列4-8位（PAM为21-23位）的A碱基和不同区域的C碱基进行同时编辑。

CRISPR技术在研究蛋白编码的致死基因时通常无法获得突变体，而在研究非编码基因时引入的indel往往又不足以实现功能失活。为解决这些问题，作者进一步利用所开发的碱基编辑工具箱，一方面通过将蛋白编码基因5’UTR内的ACG、ATA或AGA突变为ATG而创造合适的上游开放阅读框（uORF），从而抑制下游的主要ORF而实现程度可控的基因失活；另一方面通过突变非编码基因中的核心序列（如miRNA海绵中的miRNA结合序列）而使其失活。值得一提的是，该课题组此前利用碱基编辑器突变靶基因的内含子剪接位点，通过诱导内含子剪接错误而实现靶基因的失活（Li et al., 2019）。上述尝试拓展了碱基编辑工具在植物基因功能研究中的用途。

中山大学博士生熊翔宇和博士后黎镇祥为该论文的共同第一作者，李剑峰教授和博士后黎镇祥为共同通讯作者。硕士毕业生梁洁坪和中山大学李陈龙教授也参与了该研究。该研究得到国家转基因重大专项和广州市科技计划重点项目的资助。

李剑峰教授课题组长期致力于植物免疫信号转导和植物基因编辑技术的相关研究，期待对上述研究方向具有浓厚兴趣的博士后加入，有意者请联系：

lijfeng3@mail.sysu.edu.cn

参考文献

Zhenxiang Li, Xiangyu Xiong, Fengzhu Wang, Jieping Liang, Jian-Feng Li. (2019). Gene disruption through base editing-induced messenger RNA missplicing in plants. New Phytologist 222: 1139-1148.

论文链接：

https://doi.org/10.1093/nar/gkac166