Tbx2是耳蜗毛细胞特异性分化形成内毛细胞的主调控因子

撰文 | 阿童木

责编 | 兮

耳蜗是外周听觉系统的组成部分，能够将传入内耳的机械性声音振动信号转化成听神经生物电信号，是哺乳动物感知外界声音的关键器官。毛细胞作为听觉系统的感觉受体，位于耳蜗基底膜上的柯蒂氏器上，靠近耳蜗中心的一列称为内毛细胞（inner hair cells,IHCs），远离中心的三列称为外毛细胞（outer hair cells,OHCs）（图1）。

图1 耳蜗的构造及毛细胞的分布【1】。(A) 耳蜗的腔体结构由前庭管（Scala vestibuli）、中管（Scala media）和鼓管（Scala tympani）构成。(B) 毛细胞分布于中管柯蒂氏器上，分为内毛细胞（IHC）和外毛细胞（OHC）。

研究发现IHC和OHC的功能存在差别，内毛细胞是感受器细胞，与若干听神经纤维形成突触连接，负责将机械振动转化为与之相连的听神经纤维的动作电位；而外毛细胞与传出神经以及另一类型的传入神经形成突触，不参与声音信号的传导，但与选择性扩大声音信号的输入、提高声音的敏感性以及耳蜗的调节和自我保护机制有关【2】。

目前，已鉴定到两种参与OHC特异性分化的转录因子（INSM1和Helios），其中INSM1在胚胎期发挥作用，参与OHC的命运维持，阻遏OHC转分化为IHC【3, 4】。而在INSM1缺失时，胚胎OHC会异常表达一组与IHC特异性分化有关的核心基因，使OHC转分化为IHC【5】。然而，截止目前尚未发现参与调控IHC特异性分化的转录因子。

近日，美国西北大学Jaime García-Añoveros和Anne Duggan教授实验室合作在Nature杂志发表了题为Tbx2 is a master regulator of inner versus outer hair cell differentiation的研究文章，发现IHC中Tbx2的缺失会导致胚胎耳蜗毛细胞分化为OHC，而OHC中异位表达Tbx2会诱导OHC转分化为IHC，Tbx2是决定耳蜗毛细胞分化为IHC而非OHC的主调控因子和充分必要条件。

研究伊始，作者明确了驱动胚胎毛细胞向IHCs特异性分化的基因应具备以下几个条件，首先应该能够调控基因表达（如转录因子），其次应特异性表达于IHCs而非OHCs，第三在OHCs异常发育而转分化为IHCs的过程中（如Insm1突变体）表达。依据以上筛选标准，作者发现T-box转录因子家族的成员Tbx2（指导胚胎、组织器官轴向发育的转录因子）恰好满足所有条件，因此推测Tbx2很可能是驱动毛细胞特异性分化为IHCs的关键调控因子。

通过原位杂交，作者发现Tbx2表达于IHCs等柯蒂氏器内隔室部分，但在OHCs等柯蒂氏器外隔室部位几乎不表达。INSM1缺陷会导致部分OHCs转分化为IHCs，而Tbx2仅在INSM1缺陷所导致的转分化OHCs中表达，并与vglut3（IHCs marker）表达模式一致，但在未发生转分化的OHCs中不表达。而在Tbx2条件敲除小鼠的新生毛细胞中，IHCs部位的胚胎毛细胞表现出OHCs的生理与解剖学特征，作者将这些细胞命名为ic-OHCs。Tbx2缺陷型小鼠成熟后会产生听觉障碍与听觉脑干反应的缺失，这与功能性IHCs缺失所导致的小鼠表型一致。因此，TBX2缺失会诱导IHCs部位的毛细胞转分化为OHCs，表明IHCs在TBX2的调控下才能分化并发育为与OHCs不同的细胞。对ic-OHCs的功能进行分析后，作者发现这些细胞具有OHCs的基底外侧电流特征和OHCs最显著的电动（electromotile）特性。可见，Tbx2条件敲除所产生的ic-OHCs不仅具有OHCs的生理与解剖学特征，还具有OHCs的正常生理功能。

结合上述发现与先前研究，作者确定Tbx2缺失时胚胎IHC表达INSM1并分化为OHC，而在INSM1缺失时，一部分胚胎OHC表达TBX2 并转分化为IHC。那么胚胎期IHC转分化为OHC以及OHC转分化为IHC是否分别需要INSM1和TBX2d的参与呢？作者构建了胚胎期IHCs和OHCs发生TBX2和INSM1缺陷的转基因小鼠，发现该转基因小鼠的全部IHCs会转分化为OHCs，但OHCs并未转分化为IHCs，表明Tbx2对Insm1具有上位性（epistatic）。

TBX2在IHCs中的表达具有持续性，IHCs在耳蜗底部E15.5胚胎期开始分化，并在出生后继续分化，因此作者接下来探究了TBX2在IHCs分化后期是否是必需的。出生后小鼠中条件性敲除Tbx2会导致IHCs几乎完全转分化为OHCs，形态上也更趋近与OHCs，但这些出生后转分化细胞的静纤毛结构由于在胚胎期已基本发育完成，因此呈现IHCs的特征。因此，除了启动胚胎形成过程中IHCs的特异性分化外，TBX2在整个出生后的发育阶段中（至少到P9）也是IHCs继续维持其已经获得的IHC特征并抑制其产生OHCs的特征所必需的。简而言之，IHCs需要TBX2来维持其分化状态。

IHCs中敲除Tbx2会使其转化为OHCs，而INSM1缺陷型OHCs中敲除Tbx2会抑制OHCs转化为IHCs，那么在OHCs中异位表达Tbx2是否会使其转化为IHCs呢？利用TBX2-IRES-mCherry腺病毒载体转染耳蜗外植体以异位表达TBX2，同时从IHCs中敲除内源性Tbx2后，作者发现缺失Tbx2且未转染外源性Tbx2的IHCs会转分化为OHCs，而转染后的IHCs并未发生转分化，可见异位表达TBX2能够回补IHCs内源性TBX2的缺失。接下来，作者发现转染野生型耳蜗外植体而异位表达Tbx2后，OHCs会发生转分化而成为IHCs。因此，TBX2是诱导耳蜗毛细胞分化为IHC而非OHC的充分必要条件。

综上所述，作者发现胚胎IHC中敲除Tbx2会导致其转分化为OHCs并在原本的IHC部位发育为成熟的OHCs，而若在出生后敲除Tbx2会使高度分化的IHC直接转分化为OHC，且具有成熟而非胚胎OHC的特征。另一方面，OHCs中异位表达Tbx2会导致OHCs转分化为IHCs。本研究揭示了转录因子Tbx2是耳蜗毛细胞分化过程中向IHC而非OHC分化，并在整个分化与发育过程中维持IHC与OHC差异性的充分必要条件。

https://doi.org/10.1038/s41586-022-04668-3

制版人：十一

参考文献

1. Goutman, J. D., et al. (2015). Cochlear hair cells: the sound-sensing machines.FEBS letters, 589(22), 3354-3361.

2. Hudspeth, A. J. (2014). Integrating the active process of hair cells with cochlear function.Nature Reviews Neuroscience, 15(9), 600-614.

3. Wiwatpanit, T., et al. (2018). Trans-differentiation of outer hair cells into inner hair cells in the absence of INSM1.Nature, 563(7733), 691-695.

4. Chessum, L., et al. (2018). Helios is a key transcriptional regulator of outer hair cell maturation.Nature, 563(7733), 696-700.

5. Lorenzen, S. M., et al. (2015). Insm1 promotes neurogenic proliferation in delaminated otic progenitors.Mechanisms of development, 138, 233-245.

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