孙涛等开发仿生肿瘤免疫抑制外泌体有助于减轻脓毒症炎症因子风暴

脓毒症（sepsis）是由病原微生物急性感染引起的先天免疫系统过度活化所导致的系统性炎性综合征，每年约有1100万人因脓毒症而死亡，占全球死亡人数的19.7%（超过因癌症而死亡的人数），但目前尚无特殊有效的治疗方法。其主要特征为在感染后出现免疫亢进和炎症因子风暴，进而加重组织损伤引发多器官衰竭，改善脓毒症病理进程中免疫过度激活产生的炎症因子风暴是其治疗的关键。前期研究意外发现荷瘤小鼠可对抗脓毒症，同时流行病学研究显示，不同癌症亚型之间脓毒症发病率有很大差异，其中黑色素瘤患者的脓毒症发病率显著降低，这可能与神经内分泌组织源性肿瘤的防御机制有关。由于肿瘤患者机体通常处于由肿瘤引发的免疫抑制状态，这提示肿瘤对机体的免疫抑制作用一定程度上或可对抗脓毒症引起的免疫过度激活状态，进而使机体免疫达到平衡，起到缓解脓毒症的作用。学习并利用肿瘤的免疫抑制能力这一“盾”，来防御脓毒症的免疫过度激活这一“矛”，将可能是脓毒症炎症因子风暴仿生治疗的新策略。

近日，南开大学药学院与天津市第四中心医院、天津市第三中心医院合作在Advanced Materials上发表了文章Biomimetic Immunosuppressive Exosomes that Inhibit Cytokine Storms Contribute to the Alleviation of Sepsis，从“机体免疫稳态调节”的角度设计并制备了“仿生肿瘤免疫抑制性外泌体”，用于改善脓毒症相关炎症因子风暴，阻遏脓毒症进展，为外泌体及衍生核酸药物治疗脓毒症和炎症因子风暴相关疾病提供了新的思路。

基于前期工作中意外发现荷瘤小鼠可对抗脓毒症的现象，研究团队首先验证了荷瘤处理对于脓毒症模型（“tumor bearing-then-sepsis”）具有改善作用。但是由于肿瘤本身后期也会导致小鼠死亡，课题组尝试用中空纤维管束缚肿瘤细胞后再植入小鼠背部，以方便实验结束后取出肿瘤细胞，结果显示该方法也能够缓解“tumor bearing-then-sepsis”脓毒症模型的进程。由于肿瘤细胞侵袭能力过强，少量细胞依然能够从纤维管侧壁微孔逃逸并形成小的肿瘤灶，课题组进一步改进了方案，将双氧水诱导的senescence-associated secretory phenotype（SASP）肿瘤细胞装入中空纤维管检测该方法是否能更安全的改善脓毒症。双氧水可以诱导B16-F10细胞处于SASP状态，并且该状态下B16-F10的增殖、侵袭能力显著下降；动物实验结果显示，该方法对LPS诱导的小鼠脓毒症模型也具有改善作用。诱导老化的肿瘤细胞依然存在从中空纤维管中逃逸的风险，不利于后续的临床应用，因此课题组对肿瘤细胞发挥改善脓毒症作用的主要机制进行探索，为后续的应用研究提供支持。通过收集“tumor bearing-then-sepsis”模型存活下来的小鼠体内中空纤维管中的肿瘤细胞并进行培养后，利用超速离心法分离获得细胞因子和外泌体，发现肿瘤细胞释放的外泌体能够提高LPS诱导的脓毒症模型小鼠的生存率，而细胞因子的作用较弱。

为了在体外模拟“tumor bearing-then-sepsis”模型中肿瘤细胞外泌体的功能，课题组尝试对体外培养的肿瘤细胞用LPS进行诱导，发现LPS处理后肿瘤细胞分泌的诱导性外泌体（iExo）与普通肿瘤细胞分泌的外泌体（nExo）相比具有更好的改善脓毒症的作用。同时，扫描电镜结果显示iExo比nExo粒径更大，内径/外径的比值更高，表明其可能负载了更多的内容物。内皮细胞损伤和免疫系统激活在脓毒症病理进程中发挥着重要的作用。课题组首先对外源性外泌体能否被细胞内化进行检测，发现nExo和iExo都能够被巨噬细胞RAW264.7和内皮细胞HUVEC摄取，并且呈现一定的剂量依赖性。组学分析及细胞功能实验显示，iExo能够促进LPS诱导的RAW264.7细胞由M1促炎表型向M2抗炎表型极化并且改善炎症诱导的内皮细胞损伤。

miRNAs和蛋白质是外泌体发挥作用的主要成分。利用RNA酶和Proteinase K分别处理iExo后进行活性检测，发现miRNAs是外泌体发挥功能的主要成分。对两种外泌体的miRNAs进行测序分析发现7种miRNAs（miR-7651-5p、miR-615-5p、miR-6239、miR-690、miR-206-3p、miR-466i-5p、miR-146a-5p）在iExo中特异性富集。为了进一步阐明iExo对RAW264.7和HUVEC细胞的影响，对iExo处理的细胞进行转录组测序，将miRNAs与mRNA的表达谱结合分析，建立两者之间的ceRNA网络。GSEA富集分析也进一步证明iExo通过稳定免疫系统和内皮细胞功能发挥对抗脓毒症的作用。根据iExo中特异性存在的7种miRNAs表达量的相对丰度，赋予每个miRNA不同权重进行加权分析，阐释其对不同通路的影响水平，结果表明：7种miRNAs在RAW264.7细胞中主要影响TNF signaling pathway、NF-κB等通路，在HUVEC细胞中主要影响Glycerophospholipid metabolism、Cell adhesion molecules（CAMs）等通路。

为了实现仿生模拟肿瘤免疫抑制外泌体，研究团队利用HA-PEI纳米颗粒负载上述miRNAs，制备了“Exosome-mimics”。HA修饰的纳米颗粒可以靶向CD44阳性细胞（巨噬细胞和内皮细胞高表达CD44），并且该纳米颗粒不具有免疫原性，可生物降解。为了探索合适的miRNAs比例设计了多种配比，结果表明与天然iExo中miRNAs配比相同的Exosome-mimics抑制LPS诱导的炎症反应及改善血管内皮细胞损伤的作用更强且具有剂量依赖性，这表明细胞应激产生的miRNAs存在编码特性，其间比例与生物学功能具有密切关联性。最后利用小鼠和食蟹猴模型进行评价，发现“Exosome-mimics”表现出较好的脓毒症改善作用和跨物种特性，可改善血液、生化等指标及一般状态，有望开发为治疗脓毒症的药物。

图1. 仿生肿瘤免疫抑制外泌体减轻脓毒症炎症因子风暴的研究思路。

本研究通过学习肿瘤的特性挖掘生物体内潜在的平衡能力以治疗其他疾病，仿生肿瘤发挥免疫抑制性的主要媒介——外泌体，设计exosome mimics作为“盾”抑制脓毒症中免疫过度激活带来的损伤，调节机体免疫正常化，为外泌体及衍生核酸药物治疗脓毒症和炎症因子风暴相关疾病提供了新的思路。利用细菌胞壁主要成分——LPS模拟脓毒症体内环境，刺激肿瘤细胞产生的iExo具有改善炎症风暴的作用，而静息状态下产生的普通外泌体则作用微弱。这也提示，肿瘤细胞外泌体的功能与外部的刺激条件关系密切，为更多功能特异性外泌体的开发提供了依据。采用HA-PEI纳米颗粒作为递送载体对7种特异性miRNAs进行包裹来模拟外泌体，可发挥与天然外泌体近似或更强的治疗作用，有望解决外泌体难以规模化生产和质控困难的问题。

该工作由南开大学李伊楠博士、张恒博士为论文共同第一作者，南开大学孙涛教授，刘慧娟副研究员，天津市第四中心医院张杨主任，天津市第三中心医院高文卿主任为共同通讯作者。

https://doi.org/10.1002/adma.202108476

制版人：十一

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