意义重大！安徽医科大学左莉等发现克罗恩病的潜在治疗靶点

肠屏障丧失是克罗恩病 (CD) 的危险因素。这可能与肌球蛋白轻链激酶 1 (MLCK1) 的表达增加和酶促激活有关，后者增加了肠道旁细胞通透性并与 CD 严重程度相关。此外，临床前研究表明，肿瘤坏死因子 (TNF) 诱导的屏障丧失以及实验性炎症性肠病进展需要 MLCK1 募集到细胞连接处。该研究试图确定 MLCK1 募集的机制，并在药理学上针对这一过程。

2022年5月10日，安徽医科大学左莉及哈佛医学院Jerrold R Turner共同通讯在Gut（IF=23）在线发表题为“Tacrolimus-binding protein FKBP8 directs myosin light chain kinase-dependent barrier regulation and is a potential therapeutic target in Crohn’s disease”的研究论文，该研究发现MLCK1 与他克莫司结合的 FKBP8 PPI 结构域特异性相互作用。敲除或显性负 FKBP8 表达可防止 TNF 诱导的 MLCK1 募集和体外屏障丧失。MLCK1-FKBP8 结合被他克莫司阻断，在体外和体内逆转了 TNF 诱导的 MLCK1-FKBP8 相互作用、MLCK1 募集和屏障丧失。CD 患者的活组织检查显示，与对照受试者相比，细胞间连接处的 MLCK1-FKBP8 相互作用数量增加。

总之，该研究发现与可被他克莫司阻断的 FKBP8 结合是 MLCK1 募集到细胞间连接处和导致免疫介导屏障丧失的下游事件所必需的。观察到的 MLCK1 活性增加、细胞连接处的 MLCK1 定位和 CD 中 MLCK1-FKBP8 周围的相互作用表明靶向该过程可能对人类疾病具有治疗作用。这些对疾病相关屏障丧失机制的新见解为 FKBP8-MLCK1 相互作用的治疗开发提供了重要基础。

肠屏障保护内部环境免受包括微生物组在内的管腔材料的影响。这种屏障是由上皮细胞和细胞间紧密连接形成的，这些连接在相邻细胞之间产生选择性渗透性密封。紧密连接调节或上皮损伤可能导致屏障功能降低或通透性增加。这两种形式的屏障损失是通过不同的机制发生的，并且具有截然不同的后果。与允许细菌、大分子、离子和水不受限制的流动的上皮损伤相比，紧密连接通透性的调节增加在程度上更加有限，并且具有尺寸选择性和电荷选择性。

类似于细胞因子诱导的肠道通透性增加是克罗恩病患者健康一级亲属发生炎症性肠病 (IBD) 的危险因素。有限的通透性增加也可能是克罗恩病患者即将从缓解中复发的标志。因此，肠道通透性的小幅增加可能会显著影响人类疾病。这些观察结果表明，屏障恢复剂可以预防患有 IBD 风险增加，并且可以维持克罗恩病患者的缓解。

由 MLCK1 调节的紧密连接泄漏通路可容纳 4 kD，但不容纳 70 kD 葡聚糖。上皮损伤增加了 4 kD 和 70 Da 葡聚糖通过不受限制的途径的通量。T 细胞活化选择性地上调泄露途径，如 4 kD 葡聚糖通量和 4 kD / 70 kD 通透性比率的增加所示，而 70 kD 葡聚糖通量没有任何变化。他克莫司恢复了渗漏通路屏障功能（图源自Gut ）

肌球蛋白轻链激酶 (MLCK) 是一种典型的紧密连接调节剂，可磷酸化连接周围肌动球蛋白环内的肌球蛋白 II 调节轻链 (MLC)。这增加了对直径高达 ~ 100 Å 的分子的紧密连接渗透性。先前使用酶抑制剂或基因敲除小鼠的研究表明，急性、肿瘤坏死因子 (TNF) 诱导的体外和体内紧密连接通透性增加需要 MLCK 活性。进一步的研究表明，MLCK 介导的通透性增加驱动慢性实验性免疫介导的 IBD 和移植物抗宿主病。然而，酶促 MLCK 抑制剂不能开发为治疗剂，因为它们对平滑肌、心肌和骨骼肌 MLCK 的影响会导致心律失常、低血压、麻痹、肠蠕动和死亡。因此，针对 MLCK 以恢复屏障功能将需要替代方法。

TNF 诱导 MLCK1（在肠上皮细胞中表达的两种 MLCK 剪接变体之一）募集到结周肌动球蛋白环。MLCK2 是另一个 MLCK 剪接变体，尽管与 MLCK1 的区别仅在于 MLCK1 中唯一存在的单个 227 个核苷酸的外显子，但它并没有被募集到连接周围的肌动球蛋白环。该序列完成了一个氨基末端的免疫球蛋白样结构域 IgCAM3，它可以被一个小的药物样分子靶向，这种分子可以阻断 TNF 诱导的 MLCK1 募集，以防止 TNF 诱导的 MLC 磷酸化和屏障丧失，而不抑制 MLCK 酶活性。这种方法在减轻实验性 IBD 严重程度方面比抗 TNF 抗体更有效。

研究人员假设小分子通过干扰 IgCAM3 与另一种蛋白质的结合来阻止 MLCK1 募集到连接周围的肌动球蛋白环。为了验证这个想法，探索了人类肠道上皮 cDNA 文库以发现 MLCK1 特异性结合蛋白。这确定了 FK506 结合蛋白 FKBP8，也称为 FKBP38，这种蛋白与自噬、线粒体自噬和未折叠蛋白反应有关，但在肠上皮细胞中没有确定的功能。

该研究数据显示 MLCK1 直接与 FKBP8 结合，这些相互作用对于 MLCK1 募集、MLC 磷酸化和 TNF 诱导的屏障丧失至关重要。此外，克罗恩病患者的活组织检查显示，相对于对照受试者，MLCK1-FKBP8 相互作用增加。因此，该研究阐明了 MLCK1 募集的分子机制，并将 FKBP8 确立为炎症性疾病肠道屏障修复的治疗靶点。

参考消息：

https://gut.bmj.com/content/early/2022/05/10/gutjnl-2021-326534