PNAS | 浙江农林大学沈锦波课题组发现种子贮藏蛋白转运的重要机制

责编 | 王一

种子不仅是植物遗传繁殖器官，也是营养物质的存储场所，与人类的食物来源息息相关。“中国人的饭碗要牢牢端在自己手中，就必须把种子牢牢攥在自己手里。”因此，在研究增强植物抗逆性、提高作物产量的同时，探索改善种子品质，对保收丰产、提高人民生活水平具有重要的科学意义和实际生产意义。

在种子成熟过程中，贮藏蛋白及相关物质高效积累到种子中是决定种子质量的关键。因此，精确有序的蛋白分选和运输机制对于种子发育至关重要。目前已发现，多种囊泡运输调节因子和蛋白分选机制通过协同作用，调控贮藏蛋白从多囊泡体/液泡前体（Multivesicular Body/Prevacuolar Compartment，MVB/PVC）到蛋白贮藏型液泡（protein storage vacuoles，PSVs）的分选和运输。这主要包括：依赖于液泡分选受体（vacuolar sorting receptor，VSR）介导的贮藏蛋白的分选机制；依赖于逆转运复合体（Retromer）调控VSR的回收及循环利用的分子机制。

内吞体分选转运复合体（endosomal sorting complex required for transport，ESCRT）是一类进化上保守的蛋白分选转运复合体, 但其主要负责膜蛋白（如生长素转运蛋白PINs、植物模式识别受体FLS2等）分选，经过MVB/PVC进入液泡降解。绝大部分ESCRT复合体组分蛋白的缺失，均会导致MVB/PVC发生缺陷、膜蛋白积累，导致植株生长不正常甚至死亡。虽然已有研究暗示植物ESCRT参与种子发育，但其在种子内如何参与囊泡转运的分子机制并不清楚。

2022年5月 9日，浙江农林大学沈锦波教授课题组在PNAS在线发表了题为“Plant ESCRT Protein ALIX Coordinates with Retromer Complex in Regulating Receptor Mediated Sorting of Soluble Vacuolar Proteins”的研究论文，揭示了ESCRT蛋白ALIX与逆转运复合体Retromer相互协作，调控贮藏蛋白在种子液泡中存储的分子机制，为培育高质量、高品质的农林作物种子提供理论依据。

该研究中，研究人员发现ESCRT蛋白ALIX基因缺失突变体能形成不正常的黄化种子，且种子没有活性。Western Blot检测显示大量贮藏蛋白，如2S白蛋白（2S albumin）和12S球蛋白（12S globulin），以前体的形式积累在突变体中（图1A）。利用激光共聚焦显微镜和透射电子显微镜结合免疫胶体金标记技术，对黄化的种子观察发现，原本定位于PSV的贮藏蛋白GFP-CT24和2S白蛋白、12S球蛋白被大量分泌到细胞间隙（图1B-F），证明ALIX对于贮藏蛋白到PSV的运输是必需的。

图1. ALIX基因功能缺失导致种子贮藏蛋白不能正常存储，被错误分泌到细胞间隙中

为探究这一种子蛋白存储过程中与ALIX协同作用的调控因子，研究人员利用免疫共沉淀-质谱（IP-MS）蛋白质组学技术，鉴定到了ALIX的互作蛋白Vps26A，其是逆转运复合体Retromer的重要组分之一。利用Co-IP、Pull-down和Y2H多种蛋白互作技术，研究人员证明ALIX通过其内的bro1结构域与逆转运复合体具有强互作关系，还进一步证明了在种子发育过程中ALIX与逆转运复合体具有遗传互作关系，表现为双突变体种子发育存在严重的缺陷。亚细胞定位观察显示，ALIX与Vps26A和Vps29均具有一定比例的共定位关系，且功能完整的ALIX对于Vps26A和Vps29定位到MVB/PVC膜上具有重要调控作用。

最后，研究人员证实，2S和12S等贮藏型蛋白被分泌到细胞间隙的主要原因是由于ALIX基因功能缺失而导致液泡分选受体VSR无法正常行使功能而引起的。原本定位于MVB/PVC的GFP-AtVSR1在alix突变体中被错误的锚定于质膜上，且在细胞质中形成较大的簇状结构（图2A），且VSR的降解受到抑制（图2B-D）。免疫胶体金标记显示，突变体中VSR聚集定位到类似于DVs（dense vesicles）的结构上，并最终与细胞膜的融合（图2E-F）。由此，该研究指出ALIX与Retromer复合体协同作用，维持VSR处于囊泡分选过程中的稳态，调控贮藏蛋白被精确分选到种子液泡进行存储。

图2. ALIX突变导致液泡分选受体VSR异常聚集，且错误锚定于质膜。

浙江农林大学省部共建亚热带森林培育国家重点实验室为该论文第一单位，沈锦波教授为该论文通讯作者，博士后胡帅为该论文第一作者，硕士生吴凡，博士生朱冬梅为共同作者。香港中文大学姜里文教授，李白颖博士；华南师范大学高彩吉教授；西班牙国家研究委员会Jan Zouhar， Enrique Rojo；日本京都大学Tomoo Shimada和日本甲南大学Ikuko Hara-Nishimura教授均对本研究做出贡献。此研究获国家自然科学基金、浙江省杰青项目等多项基金资助。

沈锦波教授于2013香港中文大学生物系获得博士学位，2018年入选浙江省海外高层次人才，进入浙江农林大学从事科学研究。综合细胞生物学、分子生物学、遗传学、蛋白质组学等技术方法，在模式植物、农林作物中重点研究植物囊泡运输过程在植物生长发育、逆境响应中的调控作用机理研究。在PNAS, Nature Communications, Molecular Plant, Plant Cell, Trends in Plant Science等发表一系列高水平论文。

论文链接：

https://www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.2200492119