基因编辑技术对抗潜伏的艾滋病病毒

潜伏的HIV前病毒是艾滋病不能被治愈的一个重要原因，如何靶向清除整合在宿主染色体上的HIV前病毒是目前抗艾滋病病毒研究领域最富有挑战性的科学问题之一。

文/朱豫琪 潘晗雨 朱焕章

人类免疫缺陷病毒（HIV），也称为艾滋病病毒，为逆转录病毒中的一种，分为HIV-1与HIV-2两型。HIV-1是引发艾滋病的主要病源，其感染后会通过人体的基因组复制系统完成病毒自身的复制，严重破坏人体的免疫系统。因此，艾滋病成为严重威胁人类健康的“杀手”。

目前，艾滋病的临床治疗主要通过高效抗逆转录病毒疗法（HAART）最大限度地抑制患者体内病毒的复制，使血浆病毒载量降低至现有常规方法无法检测到的数值。然而，一旦停止抗病毒药物治疗，病毒载量又会反弹到治疗前水平，重新感染人体。因此，艾滋病不能被治愈的一个重要原因是潜伏的HIV前病毒的存在，而如何靶向清除整合在宿主靶细胞染色体上的HIV前病毒是目前抗艾滋病病毒研究领域最富有挑战性的科学问题之一。倘若能将整合的HIV前病毒从宿主靶细胞基因组上敲除，就可从根本上解决艾滋病不能治愈的问题，实现“斩草除根”的梦想。

目前，国际上已有近30种抗逆转录病毒药物应用于艾滋病的临床治疗，但是现有的这些药物只能抑制病毒复制，不能清除艾滋病病毒，其原因是艾滋病病毒可潜伏于少数免疫细胞，以此逃脱机体免疫系统和抗逆转录病毒药物的攻击。因此，研发靶向激活潜伏的HIV前病毒或者清除HIV的新型治疗技术已成为国际上艾滋病治疗研究领域的发展趋势和研究热点。

基因编辑技术的出现无疑为威胁人类多年的艾滋病的治疗提供了新型的手段。研究人员可以通过基因编辑技术敲除病毒感染辅助受体或是病毒基因组，以达到阻断病毒感染、抑制病毒复制的目的。目前，多个基因编辑技术临床试验方案已被美国食品药品监督管理局（FDA）批准应用到抗肿瘤或是抗艾滋病的基因治疗研究中。

斩草除根：切断病毒基因组

艾滋病患者自体T细胞回输这一研究成果显示，对T细胞的改造可使艾滋病患者免于药物的长期治疗，推进功能性治愈艾滋病的步伐。然而，上述治疗仍存在一定的不足之处：经锌指蛋白核酸内切酶（ZFNs）修饰的T细胞需要经体内回输，耗时较长；ZFNs修饰的T细胞仅对R5嗜性病毒有抵抗作用，但对X4嗜性病毒无抵抗作用；经ZFNs修饰的T细胞可以阻断病毒的感染，但对乘机进入或是潜伏在宿主染色体上的HIV前病毒束手无策。这些病毒的存在势必会造成HIV的再次感染。因此，我们需要一种新的根除艾滋病病毒的手段。

2013年6月27日，我们课题组首次利用ZFNs技术在HIV感染及潜伏感染的细胞模型上证实了“斩草除根”治疗策略的有效性，为彻底根除HIV开辟了一条新的途径。相关研究成果发表在《核酸研究》（Nucleic Acids Research）杂志上。

我们获得了一对能够特异靶向大多数HIV长末端重复序列（LTR）的ZFNs，在多个HIV感染及潜伏感染的细胞模型上证实了ZFNs能够特异靶向LTR并介导整合的全长HIV前病毒基因组的高效切除，获得了显著抗HIV感染的效果。该策略将可能成为一个可选择地根除HIV的治疗手段。但是，将该策略应用到临床可能还需要一段时间。

目前，已经有20多个基于基因编辑技术的基因治疗方案进入临床试验，效果令人满意，但安全性问题仍需要考虑，如脱靶效应和免疫原性等。为此，我们对ZFNs的表达进行诱导调控，解决了上述存在的问题。我们设计并构建出仅在HIV感染的细胞模型上切除HIV前病毒基因组的诱导型ZFNs表达载体，避免了因ZFNs持续表达可能引发的潜在脱靶或免疫原性问题，为该技术在临床上安全、有效应用奠定了基础。相关研究成果发表在《分子治疗核酸》（Molecular Therapy Nucleic Acids）杂志上。

我们基于反式激活因子（Tat）与病毒LTR上的反式激活应答元件（TAR）结合以促进病毒转录和复制的原理，设计并构建了以LTR为启动子，通过Tat来调控ZFNs的表达载体。在HIV感染细胞时，Tat可与ZFNs调控载体上的TAR结合以诱导ZFNs的表达，从而介导病毒基因组的切除。在此过程中，伴随病毒载量的减少，Tat表达量也会减少，由此诱导的ZFNs表达量又将恢复到基础水平，这样就可以避免因ZFNs持续表达带来的潜在脱靶问题。该研究将基于ZFNs的抗病毒治疗应用又推进了重要的一步。

引蛇出洞：靶向激活潜伏的HIV前病毒

研究人员根据病毒潜伏感染机制筛选出大量激活潜伏的HIV的药物。但是，在使用时，研究人员发现这些药物对细胞具有毒副作用及药物的非特异性结合等一系列问题。因此，寻找安全、有效且特异的激活剂尤为必要。

我们基于基因编辑技术设计并筛选出了能够特异靶向多数HIV亚型基因保守区的基因转录激活系统，如锌指蛋白和转录激活因子样效应因子重组蛋白，实现了基于基因编辑技术的“引蛇出洞”策略。我们在多个HIV潜伏感染细胞模型上证实了上述基因转录激活系统可以靶向激活潜伏的艾滋病病毒，且不会对细胞增殖活性或细胞周期产生影响。然而，上述基因转录激活系统在使用过程中会面临基因上下游序列限制等问题，在基因调控方面不能被广泛地应用。

继上述两种基因转录激活系统之后，2016年3月8日，我们再次以LTR为靶点，设计并筛选出了能够特异靶向大多数HIV亚型基因保守区LTR的第三代基因转录激活系统，在HIV潜伏感染细胞模型和原代细胞上证实了该系统的有效性、安全性及特异性。该方法设计简单、应用灵活，为抗HIV潜伏的基因治疗提供了新的前景和平台。相关研究成果发表在《分子治疗》（Molecular Therapy）杂志上。

基因沉默：靶向抑制HIV前病毒的表达

HIV前病毒基因在潜伏感染细胞中的沉默具有可逆性，一旦遇到适当的条件，“沉睡”的病毒基因就会被唤醒，迅速在机体内复制、转录。研究人员设想，倘若能使潜伏感染细胞中的HIV前病毒永久沉默，则有可能实现宿主与HIV“和平共处”的状态，而与HIV极为相似的人类内源性逆转录病毒（HERVs）在基因组中的大量存在则为这种假说提供了理论依据。

为了证实该假说，我们以HIV转录调控区LTR上的保守区为靶点，基于基因编辑技术构建了以锌指蛋白为DNA结合域的嵌合甲基转移酶ZF-Dnmt1以及以dCas9/sgRNA为DNA结合域的嵌合甲基转移酶dCas9-Dnmt3a。我们在细胞水平检测了上述嵌合蛋白的表达并在细胞模型上筛选了靶点，然后将基于基因编辑技术的嵌合甲基转移酶转染至HIV假病毒感染的细胞模型及潜伏感染的细胞模型中验证其生物活性。结果表明，这些嵌合甲基转移酶可以显著抑制HIV前病毒的表达，其作用机制与靶向HIV前病毒转录调控区LTR转录起始位点两侧的CpG岛甲基化水平升高有关。该研究还显示，基于嵌合甲基转移酶的靶向抑制作用分别能够在HIV感染和潜伏感染的细胞模型上持续15天和40天以上，说明嵌合甲基转移酶对HIV前病毒表达的抑制作用具有持久性。最后，我们在T细胞模型中证明了这些嵌合甲基转移酶具有较好的安全性。这些结果支持了DNA甲基化与HIV基因沉默的相关性，证明了宿主细胞与HIV“和平共处”策略的可能性。该研究不仅有助于病毒潜伏的表观遗传学机制研究，而且从全新的角度提出了一个治愈艾滋病的方法，同时也为靶向基因沉默提供了可能的工具。

深挖机制：揭示HIV潜伏感染基因

目前，HIV潜伏分子机制及其功能性治愈策略仍在探索中。我们利用CRISPR/Cas9基因编辑技术大规模敲除基因，在HIV潜伏感染的细胞模型和原代CD4+T细胞中筛选到了PEBP1。PEBP1（或称RKIP）是HIV潜伏感染的重要基因之一，在病毒潜伏库的建立和维持中起着关键作用。随后，我们发现，绿茶提取物EGCG可以在原代CD4+T细胞中诱导PEBP1高表达，并证实EGCG可以通过诱导PEBP1的表达而抑制HIV的感染和复制。上述结果提示，PEBP1的发现为HIV潜伏感染与复制机制的研究提供了新的方向。同时，该研究也为艾滋病功能性治愈提供了潜在的药物干预靶点，而EGCG或有可能成为干预艾滋病病毒深度潜伏的候选药物。相关研究成果发表在《欧洲分子生物学组织报道》（EMBO Reports）杂志上。

朱豫琪，复旦大学生命科学学院艾滋病基因治疗研究室博士研究生，曾获硕士生优秀学业奖学金。

潘晗雨，复旦大学生命科学学院艾滋病基因治疗研究室博士研究生，曾获硕士生国家奖学金、博士生优秀学业奖学金。

朱焕章，复旦大学遗传工程国家重点实验室教授，博士生导师，基因技术教育部工程研究中心副主任，“传染病防治”国家重大专项评审专家，国家科技奖评审专家，先后主持包括“新药创制”“传染病防治”国家重大专项及中美合作项目在内的国家级课题20余项，发表学术文章50余篇，授权中国发明专利20项及美国专利1项。