3篇Nat Biotechnol!北京大学魏文胜在碱基编辑领域取得重大进展

目前使用内源性 ADAR 酶和工程化 ADAR 招募 RNA (arRNA) 进行程序化 RNA 编辑的方法存在效率低和旁观者脱靶编辑的问题。

2022年2月10日，北京大学魏文胜团队在Nature Biotechnology 杂志发表“Engineered circular ADAR-recruiting RNAs increase the efficiency and fidelity of RNA editing in vitro and in vivo”的研究论文，该研究描述了 LEAPER 2.0，这是 LEAPER 的更新版本，它使用共价闭合的环状 arRNA，称为 circ-arRNA。

当在细胞中表达或作为体外转录的环状 RNA 寡核苷酸递送时，该研究展示了平均比线性对应物高约 3.1 倍的编辑效率。为了降低脱靶编辑，该研究删除了尿苷与脱靶腺苷的配对，这几乎完全消除了旁观者的脱靶腺苷编辑。工程化的 circ-arRNA 提高了在细胞培养中编辑内源性 CTNNB1 和突变体 TP53 转录物的效率和保真度。在 Hurler 综合征小鼠模型中使用腺相关病毒递送 circ-arRNA 可纠正致病点突变并恢复 α-L-艾杜糖苷酸酶催化活性，从而降低肝中糖胺聚糖的积累。LEAPER 2.0 提供了一种新的 arRNA 设计，可实现更精确、更高效的 RNA 编辑，并广泛适用于治疗和基础研究。

另外，2021年6月21日，北京大学魏文胜团队在Nature Biotechnology 在线发表题为“Genome-wide interrogation of gene functions through base editor screens empowered by barcoded sgRNAs”的研究论文，该研究报告了一种独立于 DSB 的全基因组 CRISPR 筛选方法，称为 iBARed 胞嘧啶碱基编辑介导的基因 KO (BARBEKO)。该方法通过扰乱基因起始密码子或剪接位点，或通过引入过早终止密码子，利用 CRISPR 胞嘧啶碱基编辑器进行基因组规模的 KO 筛选。此外，它与 iBAR 集成，这是为提高筛选质量和效率而设计的策略。通过以高感染复数（最多 10 个）慢病毒感染构建这样的细胞文库，该研究获得了有效且准确的筛选结果，同时大大减少了起始细胞。更重要的是，与 Cas9 介导的筛选相比，BARBEKO 筛选不再受 HeLa、K562 或 DSB 敏感的视网膜色素上皮 1 细胞中 DNA 裂解诱导的细胞毒性的影响。总之，这些结果表明，BARBEKO方法为原代细胞、类器官或模式动物体内等复杂生物模型的高通量筛选提供了更优的选择；为数量受限的细胞样品（如病人来源的细胞）提供了高效筛选方案，因此是基因功能和临床前研究的有力工具（点击阅读）。

2019年7月15日，北京大学魏文胜团队在Nature Biotechnology在线发表了题为“Programmable RNA editing by recruiting endogenous ADAR using engineered RNAs”的研究论文，首次报道了名为LEAPER的新型RNA 单碱基编辑技术。与传统的核酸编辑技术需要向细胞同时递送编辑酶(如Cas蛋白)及向导RNA不同，LEAPER系统仅需要在细胞中表达向导RNA即可招募细胞内源脱氨酶实现靶向目标RNA的编辑。利用该技术，研究人员在一系列疾病相关基因转录本中实现了高效、精准的编辑，并成功修复了来源于Hurler综合征病人的α-L-艾杜糖醛酸酶缺陷细胞。该技术的建立为生命科学基础研究和疾病治疗提供了一种全新的工具。

基因组编辑工具，如锌指核酸酶、转录激活因子样效应核酸酶、CRISPR-Cas 系统和 CRISPR-Cas 衍生物（胞嘧啶和腺苷碱基编辑器）已广泛应用于基因组的操作，揭示了它们的治疗潜力。除了基因组编辑技术外，还开发了 RNA 碱基编辑技术。由于 RNA 编辑是可逆和可调的，不会导致基因组发生永久性变化，因此它在治疗应用中可能具有一定的优势。

对于腺苷的 RNA 编辑，作用于 RNA (ADAR) 家族的腺苷脱氨酶成员，例如 ADAR1（同工型 p110 和 p150）和 ADAR2，已被设计用于将腺苷 (A) 精确转化为肌苷 (I)。ADAR1/2 的催化底物是双链 RNA，ADAR1/2 的脱氨酶结构域负责 A-to-I RNA 编辑。肌苷被认为是鸟苷 (G)，并在随后的细胞翻译过程中与胞苷 (C) 配对。

为了实现靶向 RNA 编辑，ADAR 蛋白或其脱氨酶结构域 ADARDD 已与多种 RNA 靶向模块融合，例如 λN 肽、SNAP 标签和 Cas13 蛋白。此外，靶向 RNA 编辑可以通过带有 R/G 基序的工程化引导 RNA 与异位表达的 ADAR1 或 ADAR2 蛋白结合来实现。

LEAPER 2.0 — 通过工程化的circ-arRNA实现高效、精准的RNA编辑（图源自Nature Biotechnology ）

然而，外源编辑酶的异位表达与几个问题有关，包括基因组和/或 RNA 转录本的大量全局脱靶编辑、免疫原性、致癌性和传递障碍。两种 RNA 编辑技术 RESTORE 和 LEAPER 利用内源 ADAR 对 RNA 进行可编程编辑，而无需引入外源蛋白质。LEAPER 使用工程线性 arRNA，可以通过病毒载体在体内表达或体外化学合成产生。

为了增强该系统的功能，该研究的目标是提高其编辑效率并最大限度地减少其脱靶编辑。因为编辑效率取决于 arRNA 的丰度和稳定性，该研究评估了环状 RNA 的使用，环状 RNA 是一大类高度稳定的非编码 RNA，因为它的共价闭合环结构可以保护它免受外切核酸酶的影响。该研究描述了 LEAPER 2.0，这是 LEAPER 的更新版本，它使用共价闭合的环状 arRNA，称为 circ-arRNA。

当在细胞中表达或作为体外转录的环状 RNA 寡核苷酸递送时，该研究展示了平均比线性对应物高约 3.1 倍的编辑效率。为了降低脱靶编辑，该研究删除了尿苷与脱靶腺苷的配对，这几乎完全消除了旁观者的脱靶腺苷编辑。工程化的 circ-arRNA 提高了在细胞培养中编辑内源性 CTNNB1 和突变体 TP53 转录物的效率和保真度。在 Hurler 综合征小鼠模型中使用腺相关病毒递送 circ-arRNA 可纠正致病点突变并恢复 α-L-艾杜糖苷酸酶催化活性，从而降低肝中糖胺聚糖的积累。 LEAPER 2.0 提供了一种新的 arRNA 设计，可实现更精确、更高效的 RNA 编辑，并广泛适用于治疗和基础研究。

北京大学魏文胜课题组博士研究生伊宗裔（CLS）、博士后璩良和博士研究生唐慧贤（BIOPIC）为该论文的共同第一作者。该研究项目得到了国家重点研发计划、国家自然科学基金重点项目、北京市科委生物医学前沿创新推进项目、北京未来基因诊断高精尖创新中心、北大-清华生命科学联合中心以及中国博士后科学基金的支持。

参考消息：

https://www.nature.com/articles/s41587-021-01180-3