生命在于运动，运动维持健康。
现代社会中胰岛素抵抗和2型糖尿病等代谢疾病的流行，与人体力劳动和运动的普遍缺乏密切相关[1]。然而，运动的缺乏在2型糖尿病病理生理中的作用，以及运动如何改善胰岛素抵抗，仍困惑着广大医学研究人员。
前不久，国际顶级期刊《科学》子刊Science Advances公布了澳大利亚莫纳什大学Tony Tiganis教授在内分泌和运动医学领域的一项重磅研究成果[2]。
他们发现，运动通过诱导骨骼肌NOX4表达，促进ROS介导的适应性反应，进而增强肌肉功能，维持氧化还原平衡，逆转胰岛素抵抗。这一发现从氧化应激的角度详细揭示了运动维持血糖健康的机制，为衰老和肥胖相关的胰岛素抵抗提供了一个潜在的治疗靶点。
▲Science Advances网站本论文
既往已有多项动物实验和人群试验证实运动能促进线粒体生成，增加胰岛素敏感性[3]。有研究认为这与运动引起的ROS产生和KEAP1/NFE2L2通路激活有关。
ROS是细胞呼吸的自然副产物，包括H2O2、O2•−和•OH等，是细胞的内源性氧化剂。运动期间ROS的产生主要由NOX家族催化，其中，NOX4位于骨骼肌细胞，能直接产生H2O2和O2•−。运动后，ROS氧化KEAP1，导致与KEAP1结合的转录因子NFE2L2得以释放入核，促进线粒体相关基因和抗氧化防御系统基因的表达。然而迄今为止，详细机制尚未完全阐明。
于是，Tiganis团队以NFE2L2和NOX4为突破口，首先检测了二者在小鼠和人类骨骼肌运动前后的变化情况，发现运动后NFE2L2和NOX4表达上调。考虑到NFE2L2能与NOX4启动子区域结合，研究人员推断NOX4是NFE2L2的靶基因，运动通过上调NFE2L2而促进NOX4表达。
为了证明这一推测，Tiganis团队使用NFE2L2的激活剂——莱菔（lái fú，萝卜）硫烷，代替运动刺激NFE2L2，进行细胞和动物实验，观察NOX4表达情况。他们发现：成肌细胞和小鼠经莱菔硫烷处理后，NOX4表达升高；而敲除NFE2L2后，莱菔硫烷的处理不能提高NOX4表达。这一结果验证了他们的猜想。
随后，Tiganis团队研究了骨骼肌NOX4缺失对ROS生成的影响，发现敲除成肌细胞的NOX4后，H2O2生成减少，运动状态下的H2O2激发生成也被消除。这证明ROS生成必需骨骼肌NOX4。此外，特异性敲除小鼠骨骼肌的NOX4后，在ROS生成减少的同时，运动能力和运动耐力也显著降低。
那么ROS生成减少和运动能力降低，这两者之间又是什么关系呢？考虑到氧化还原酶GPX-1能通过还原H2O2来消除ROS，于是，Tiganis团队沉默了NOX4敲除鼠的GPX-1基因，以抵消NOX4敲除引起的ROS减少。他们发现，敲除GPX-1后，NOX4敲除鼠的运动能力和耐力随H2O2水平恢复了正常。因此，骨骼肌NOX4敲除通过减少H2O2生成，而损害运动能力。
▲图E：H2O2在NOX4敲除后生成减少，再敲除GPX-1后可被恢复；图F和G：鼠运动能力在NOX4敲除后生成减少，再敲除GPX-1后可被恢复。（Nox4fl/fl为对照用野生型鼠， Mck-Cre; Nox4fl/fl为实验组骨骼肌NOX4敲除鼠，Mck-Cre; Nox4fl/fl,Gpx1-/-为实验组骨骼肌GPX-1与NOX4双敲除鼠）
之前有研究表明，运动能力的强弱与骨骼肌线粒体含量的多寡有关[4]。于是，Tiganis团队对比了GPX-1与NOX4双敲鼠、NOX4敲除鼠和正常鼠骨骼肌中相关基因的表达情况，发现线粒体生成基因（Pcg1a、Nrf1、Nrf2和Tfam）和线粒体呼吸链相关基因，在NOX4敲除后表达降低，在NOX4敲除的基础上再敲除GPX-1后则表达恢复。这个结果在NOX4敲除的成肌细胞中也得到了验证，证明骨骼肌NOX4敲除通过降低H2O2水平，来抑制线粒体生成，进而损害小鼠的运动能力。
实际上，已有研究发现NFE2L2参与运动诱导的线粒体生成，NFE2L2激活剂莱菔硫烷能增强小鼠运动能力。因此，Tiganis团队推测：NOX4敲除鼠线粒体生成减少引起的运动能力降低，可能和NFE2L2的缺失有关。
使用莱菔硫烷处理NOX4敲除鼠，发现NOX4敲除引起的NFE2L2表达降低得到纠正，并抑制了线粒体生成相关基因表达的减少。运动耐力检测发现，莱菔硫烷治疗挽救了NOX4敲除鼠运动耐力的下降。
这些发现证明骨骼肌NOX4敲除通过减少H2O2，而抑制NFE2L2，进而减弱线粒体生成，最终损害运动能力。
▲图A-C：线粒体生成基因在NOX4敲除后表达降低；图D和E：线粒体呼吸链相关基因在NOX4敲除后表达降低；图F：线粒体生成在NOX4敲除后减少（绿色荧光表示线粒体密度）
Tiganis团队注意到，骨骼肌收缩产生ROS，能增强NFE2L2介导的抗氧化防御[5]。而且，前期实验已证明NOX4为肌肉收缩产生ROS所必须。因此，Tiganis和他的同事提出假说：NOX4与抗氧化防御有关，即NOX4的缺失能导致抗氧化防御的缺陷。
细胞和动物实验发现，NOX4敲除引起NFE2L2及NFE2L2靶基因表达的降低，并消除运动对NFE2L2表达的促进作用。无偏蛋白质组学和WB证实，抗氧化防御基因表达下降（线粒体SOD2、GCLM、PRDX6、NQO1、PRDX1至PRDX3和H2O2酶），脂质过氧化（4-HNE）、蛋白质氧化和损伤（蛋白质羰基化）和肌肉损伤（CK）等氧化损伤增加。
在NOX4敲除的基础上再敲除GPX-1以抑制H2O2的减少，能大幅度挽救抗氧化防御基因的表达下降，减轻骨骼肌氧化损伤。因此，骨骼肌NOX4敲除通过减少H2O2，来抑制NFE2L2，进而减弱抗氧化防御，增加氧化损伤。
▲图E（WB）、图F（无偏蛋白质组学）以及图G和H（RT-PCR）：检测抗氧化防御基因在NOX4敲除后表达下降；图I（4-HNE）、图J（蛋白质羰基化）和图K（CK）：检测氧化损伤基因在NOX4敲除后表达上调
鉴于衰老引起的胰岛素抵抗和2型糖尿病与氧化损伤有关。基于上述实验已发现的NOX4/H2O2/NFE2L2/抗氧化防御信号轴，Tiganis和他的同事进一步推测：衰老小鼠的胰岛素抵抗可能归因于NOX4表达的降低。
研究人员比较了衰老鼠和年轻鼠的NOX4表达情况，发现衰老鼠骨骼肌NOX4的表达下降了46%！随后研究人员还发现NOX4敲除鼠餐后血糖和胰岛素水平升高，胰岛素反应减弱，骨骼肌对葡萄糖摄取减少，出现胰岛素抵抗。对NOX4敲除鼠敲除GPX1以积累H2O2，或服用莱菔硫烷以激活NFE2L2，都能逆转NOX4敲除鼠出现的胰岛素抵抗。
肥胖也能通过加剧全身的氧化应激促进胰岛素抵抗[6]。Tiganis团队发现，饮食诱导的肥胖小鼠骨骼肌NOX4表达减少44%！于是，他们大胆推测：NOX4缺乏能加剧饮食诱导肥胖引起的胰岛素抵抗。
Tiganis和他的同事评估了高脂饮食催肥后的NOX4敲除鼠的肌肉发育和葡萄糖稳态，发现体重、身体成分和肌肉组织形态无改变，但骨骼肌线粒体生成减少，胰岛素抵抗加剧，葡萄糖不耐受程度升高，骨骼肌葡萄糖摄取能力降低，胰岛素信号转导降低（AKT在Ser473的磷酸化水平下降），运动带来的胰岛素增敏效应也减弱。
▲图C和图E：胰岛素耐受试验发现NOX4敲除后血糖水平升高，胰岛素反应减弱；图D：AKT在Ser473的磷酸化水平经NOX4敲除后下降，予莱菔硫烷（SILF）处理后恢复。
既然线粒体SOD2缺失或线粒体内ROS增加，能降低胰岛素信号转导，促进胰岛素抵抗。那么，NOX4/H2O2/NFE2L2/抗氧化防御信号轴减弱引起的胰岛素抵抗是否与此有关呢？
Tiganis和他的同事先对NOX4敲除后的成肌细胞进行了检测，发现在H2O2生成减少和抗氧化防御基因表达降低的同时，线粒体SOD2蛋白表达降低，线粒体内O2•−增加，蛋白质羰基化增加，胰岛素信号减弱。
而使用莱菔硫烷或敲除KEAP1激活NFE2L2后，蛋白质羰基化降低，胰岛素信号恢复。使用线粒体靶向抗氧化剂，SOD模拟物，或线粒体靶向四肽SS31阻断线粒体O2•−生成，也能减少蛋白质羰基化，恢复缺陷的胰岛素信号。
这些结果表明，NOX4/H2O2/NFE2L2/抗氧化防御/线粒体氧化应激信号轴，在胰岛素抵抗的发展中发挥了重要作用。
▲论文机制示意图
科研是一场根据已知寻找未知的寻宝探险，也是一个根据线索补全残片的拼图游戏。从已知的蛛丝马迹中火眼金睛挖掘线索，尔后大胆假设小心求证，通过精妙设计的实验，步步为营，拨开未知的迷雾，找到表型的宝藏，发现残缺的碎片，填补机制的拼图。Tiganis团队的这项研究就是如此。
然而，美中不足的是实验主要围绕NOX4敲除开展，实验结论也只是根据NOX4功能缺失后的结果来反推获得。如果还能结合NOX4功能增强的角度，比如同时也构建NOX4骨骼肌特异性过表达模型，这样从正反两面来探究和阐述其在线粒体生成和胰岛素抵抗病理生理中的作用，也许会更好。
“管住嘴，迈开腿”，这句防治糖尿病的六字箴言，后半句的重要性超乎想象。所以，为了血糖健康，还不赶紧动起来！
参考文献
[1] Cartee GD, Hepple RT, Bamman MM, Zierath JR. Exercise Promotes Healthy Aging of Skeletal Muscle. Cell Metab. 2016;23(6):1034-1047. doi:10.1016/j.cmet.2016.05.007
[2] Xirouchaki CE, Jia Y, McGrath MJ, et al. Skeletal muscle NOX4 is required for adaptive responses that prevent insulin resistance. Sci Adv. 2021;7(51):eabl4988. doi:10.1126/sciadv.abl4988
[3] Egan B, Zierath JR. Exercise metabolism and the molecular regulation of skeletal muscle adaptation. Cell Metab. 2013;17(2):162-184. doi:10.1016/j.cmet.2012.12.012
[4] Merry TL, Ristow M. Mitohormesis in exercise training. Free Radic Biol Med. 2016;98:123-130. doi:10.1016/j.freeradbiomed.2015.11.032
[5] Merry TL, Ristow M. Nuclear factor erythroid-derived 2-like 2 (NFE2L2, Nrf2) mediates exercise-induced mitochondrial biogenesis and the anti-oxidant response in mice. J Physiol. 2016;594(18):5195-5207. doi:10.1113/JP271957
[6] Furukawa S, Fujita T, Shimabukuro M, et al. Increased oxidative stress in obesity and its impact on metabolic syndrome. J Clin Invest. 2004;114(12):1752-1761. doi:10.1172/JCI21625
责任编辑丨BioTalker
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