与孤独症相关的饮食偏好介导了自闭症与肠道菌群的关联

撰文 | 晴凯星

孤独症谱系障碍(ASD)是一种以社交障碍与兴趣狭窄为主要特征的神经发育障碍性疾病，是目前全球患病人数增长最快的严重疾病之一，已成为严重影响生存质量，影响人口健康的重大公共卫生问题。现有的研究认为，遗传与环境的相互作用可能是孤独症发生的重要方式，但具体分子机制尚不能明确。近年来一系列研究报道健康儿童与孤独症儿童的肠道菌群存在显著差异，多种孤独症动物模型证实了菌群通过“肠-微生物-脑”轴对子代神经发育和行为的影响，为基于肠道菌群改善孤独症样行为奠定了理论与实验基础。

2019年5月，一篇发表于Cell期刊，题为Human Gut Microbiota from Autism Spectrum Disorder Promote Behavioral Symptoms in Mice的文章指出，ASD来源患者的肠道菌群移植给无菌小鼠，会导致无菌小鼠及后代出现孤独症样行为模型，同时小鼠大脑中ASD相关基因的可变剪接也发生异常，而引发行为学异常的关键是特定微生物及其代谢产物，部分代谢产物可显著改善ASD小鼠模型的行为学异常并调节大脑的神经兴奋性。总的来说，这项研究表明肠道菌群可通过具有神经活性的代谢产物来调控小鼠的行为。

2021年3月发表于Cell期刊的论文 Dissecting the contribution of host genetics and themicrobiome in complex behaviors 指出，在孤独症风险基因Cntnap2基因敲除模型中，菌群和宿主基因相互依赖地调节了小鼠的社交行为。Cntnap2-/-小鼠的过度活跃表型则是由宿主遗传造成的，而社交行为表型受肠道菌群调控，并发现微生物通过上调四氢蝶呤合成途径中的代谢物，特异性地改善了Cntnap2-/-小鼠的社交行为缺陷。

然而，2021年11月，同样发表于Cell期刊的题为Autism-related dietary preferences mediate autism gut microbiome associations 的文章对已有的孤独症与肠道菌群研究提出质疑，引起广泛讨论。作为一项大型的ASD患者粪便宏基因组研究，作者整合了其他表型/临床数据，希望寻找各种因素与ASD症状的关联。作者最后指出，ASD患者肠道菌群的差异可能反映了与诊断特征相关的饮食偏好。

目前的共识是菌群通过代谢、免疫或者迷走神经途径影响行为。这篇文章则提出行为是/strong>为通过饮食改变菌群，一些自媒体报道认为这篇文章挑战了已有的研究成果：肠道菌群与孤独症无关。那么让我们详细研读这篇文章后回答这个问题。

前言

ASD儿童中常常观察到肠道的共患病现象（包括肠易激综合征、炎症性肠病等），已有研究报道了大量的肠道菌群与ASD的关联，并应用于临床治疗试验，但大多数针对肠道菌群与ASD的关联研究使用16s rRNA测序，且样本量有限，对混杂因素（性别、年龄、饮食、胃肠道并发症或者药物影响等）考虑得不够全面。

为补充研究中的缺陷，作者采用了来自澳大利亚ASD生物库(AAB) 和昆士兰双胞胎青少年大脑(QTAB)项目的247名儿童(aged 2–17)的粪便宏基因组及其他表型/临床数据进行研究，其中ASD患儿99例、未患病同胞（SIB）51例、无血缘关系的对照儿童（UNR）97例。

与年龄、粪便和饮食特征相比，ASD的诊断与肠道菌群关联较弱

作者使用Microba Community Profiler v2.0.2参考Microba Genome Database (MGDB) v2.0.0获得物种概况，使用Microba Gene and Pathway Profiler (MGPP) v0.1.0获得基因和通路丰度定量工具，在其他特征作为协变量进行模型调整后，评估了ASD诊断中与菌群相关的表型。与年龄、粪便粘稠度和饮食特征相比，ASD的诊断与肠道菌群物种和基因水平上的关联较弱。

差异分类菌群：Romboutsia timonensis

作者使用了ANCOM v2.1 对count数据进行加对数比转换（additive-log-ratio transformation）(offset = 1)，用于寻找差异分类群。比较ASD与SIB、UNR组(协变量:年龄、性别和饮食PC1-3)，发现 Romboutsia timonensis 在常规检测阈值（> 0.7）显示出ASD组的丰度显著降低。值得注意的是，结果并未复现已有报道的普氏菌属、厚壁菌门、梭菌群和双歧杆菌属等与ASD的关联，作者认为可能与采样偏差、测序技术和分析方式不同有关。整体的功能分析中未发现显著关联。

最后作者进一步鉴定了R. timonensis 中与ASD相关的特定基因和通路，发现6个存在显著差异的基因，功能涉及氨基酸的代谢（L-谷氨酰胺，L-赖氨酸，L-甲硫氨酸和L-苏氨酸），嘌呤和嘧啶代谢，碳水化合物代谢，以及细菌孢子萌发和dsDNA分解。

饮食多样性介导ASD与肠道菌群的关联

ASD组的饮食多样性显著低于SIB组和UNR组，饮食质量也较低，与ASD诊断和α多样性、β多样性之间的弱关联形成强烈对比。粪便稠度（较高的rBSC评分）与菌群多样性的减少密切相关。作者认为菌群多样性减少是饮食多样性减少的下游。这一现象可能解释了报道的胃肠道问题增加和重复行为增加之间的关系。

行为和偏好位于饮食和菌群多样性减少的上游

为了研究ASD诊断中的行为和偏好是否位于饮食和菌群多样性减少的上游，作者利用来自ASD、注意力缺陷多动障碍和抽动障碍（ASD-ADHD-TS）交叉特征分析的多基因评分（polygenic score, PGS）来开展统计研究。作者发现饮食多样性与ASD-ADHD-TS存在边际关系，但与菌群多样性无关。此外，作者认为重复、刻板和兴趣狭窄可能是饮食多样性减少的基础。

总的来说，作者认为ASD相关的行为和偏好导致饮食多样性减少，从而介导了ASD与肠道菌群的关系。与菌群多样性相比，所有心理评分指标都与饮食多样性具有更显著的相关性。同时作者又指出：不排除下游的菌群效应也可以反馈和影响行为的可能性。

总结

通过这项粪便宏基因组与表型数据的关联研究，作者提出 ASD 诊断与肠道菌群多样性之间的直接关联可以忽略不计，Romboutsia timonensis是唯一与ASD诊断相关的类群，并指出与ASD相关的饮食偏好和行为导致饮食多样性的减少，进一步减少了菌群多样性和粪便稠度。

评论与后记

这是一项利用宏基因组和表型数据的ASD与肠道菌群的关联研究，通过将各种表型数据纳入考量，获取可靠的关联信息。该文章对已有研究产生冲击，不乏有曲解和过度解读文章部分内容以吸引眼球。编者认为，研读文章的目的是为学其所长，避其所短，并在后续研究中补其不全，就此我们有以下看法：

1. 样本构成。肠道菌群在ASD发病中的驱动作用已在多个孤独症模型中被验证，且关注在神经发育早期（见下图）。然而Yap的研究（2021年11月发表的Cell文章）收集了2~17岁的ASD患儿粪便样本，平均年龄8.7岁，即使只利用10岁以下的样本数据，数据收集时间大多已越过了神经发育的关键时期（三岁以前是人类大脑发育的重要阶段），同时，这些患儿的症状普遍较轻，不能代表典型的孤独症群体，更无法否认菌群的驱动作用。此外，作者将SIB组排除，仅仅研究ASD/UNR组是非常不明智的，一个原因在于UNR_QTAB与其他样本组年龄差异过大；另外一个原因则是SIB组与ASD组有更相似的基因型背景，应当更适合做配对差异检测和菌群对ASD的诊断力研究。

2. 分析思路。影响生物体行为的因素多种多样，我们进行科研设计时，倾向于单一变量原则。例如，要通过无菌动物研究菌群的影响，那么除了实验组动物的无菌化处理外，尽量会保证动物的年龄、性别、基因型、饮食等因素相同；而进行患者病统流调分析时，则会进行外在影响因素的匹配，使用巢式病例对照等手段进行研究。这篇文章则反其道而行之，将外在因素纳入模型中作为协变量，使用尚未正式发表的预印本方法试图分析各项指标对结果的贡献度——当模型各个影响因素互相关联（例如存在共线性）时，这种方法的是存在风险的。

3. 宏基因组数据分析方法。作者利用了非常规的数据分析流程，在物种注释和菌群筛选时过滤了大量的罕见菌，严重降低了数据反映的菌群信息，并基于这种失真的菌群信息进行后续的功能分析和菌群与孤独症的关联研究，由此得到的结论的可信度有待商榷。此外，作者将ASD诊断与菌群多样性进行关联分析，这种分析手段在菌群与疾病的关联分析中并不常用。

4. 文章积极承认孤独症与饮食偏好间的关系，以及饮食偏好和菌群间的关系。必须看到，文章识别到了ASD与健康儿童间的差异菌（Romboutsia timonensis，经过年龄、性别、饮食偏好调整之后），以及这个差异菌与重复刻板行为存在显著相关。因此，作者实际上提供了分析证据，即健康儿童与孤独症儿童之间的差异菌可能对其孤独症样行为存在影响。

5. 其它。微生物组学研究会因人群特征、样本间异质性、采样偏差、测序技术和分析方式的不同而在可重复性上有所欠缺，近期另一篇文章Reporting guidelines for human microbiome research: the STORMS checklist给出了标准化研究的建议，值得菌群研究者参考。

最后我们的看法是：

孤独症是极为复杂的疾病，2005年，2021年Science先后将孤独症病因列为人类要回答的125个科学问题之一。流行病学研究报道：遗传因素、环境暴露、生活方式、饮食习惯、孕期感染、孕期营养等，都被认为与孤独症的发病风险有关，因此孤独症的个体差异大，病因复杂，机制不明确，而这些潜在的风险因素已在孤独症或其它疾病模型中被报道与肠道菌群紊乱有关。我们认为，在对孤独症进行基于肠道菌群的研究及其干预时，应当秉承全面科学的态度，对孤独症进行流行病学病因分型的基础上，探究这些风险因素与肠道菌群之间关联，并揭示其潜在分子机制，而非如Yap文章，在无充分的队列数据分析的前提下即做出模棱两可的结论，这种有失公允的模糊结论通过不严谨的新闻报道进一步放大后，会对学科发展、科学研究、公众认知、孤独症家庭带来巨大的伤害和错误的认知。

另附一份国外关于Yap文章的评论，以飨读者。兼听则明，也希望国内众多新闻媒体能够从更加客观公正的角度，理性深入探讨Yap的文章，科学客观的引导公众对孤独症与肠道菌群关系的认知。

图片来源：

https://www.reddit.com/r/HumanMicrobiome/comments/qs4him/autismrelated_dietary_preferences_mediate/hkcwjkp/?context=8&depth=9

制版人：十一

参考文献

1. Sharon G, Cruz NJ, Kang DW, et al. Human Gut Microbiota from Autism Spectrum Disorder Promote Behavioral Symptoms in Mice. Cell. 2019;177(6):1600-1618.e17. doi:10.1016/j.cell.2019.05.004

2. Buffington SA, Dooling SW, Sgritta M, et al. Dissecting the contribution of host genetics and the microbiome in complex behaviors. Cell. 2021;184(7):1740-1756.e16. doi:10.1016/j.cell.2021.02.009

3. Yap CX, Henders AK, Alvares GA, et al. Autism-related dietary preferences mediate autism-gut microbiome associations [published online ahead of print, 2021 Nov 5]. Cell. 2021;S0092-8674(21)01231-9. doi:10.1016/j.cell.2021.10.015

4. McDonald B, McCoy KD. Maternal microbiota in pregnancy and early life. Science. 2019;365a(6457):984-985. doi:10.1126/science.aay0618

5. Mirzayi C, Renson A; Genomic Standards Consortium; Reporting guidelines for human microbiome research: the STORMS checklist. Nat Med. 2021;27(11):1885-1892. doi:10.1038/s41591-021-01552-x

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