【疫苗研发&生产】β-丙内酯残留量检测分析方法的建立及验证

目的 建立准确快速检测灭活疫苗中β-丙内酯（β-propiolactone , BPL）含量的分析方法。方法 采用气相色谱法进行BPL含量检测，用外标法计算BPL含量。对分析方法的专属性、系统适应性、线性和范围、准确度、精密度、检测限、定量限、耐用性进行验证。结果 BPL溶液和供试品溶液在相应保留时间内可见BPL峰，阴性对照溶液未出峰。BPL峰5次进样峰面积相对标准偏差小于2%且与其他峰分离度大于1.5。BPL的浓度在1.11~35.52 μg/ml范围内与峰面积成线性关系。浓度分别为2.22、4.44和8.88 μg/ml的供试品溶液回收率在97.3%~106.9%之间，相对标准偏差均小于3%。检测限浓度为0.30 μg/ml，定量限为0.49 μg/ml。结论 建立的BPL检测方法具有良好的专属性、系统适应性、线性和范围、准确度、精密度、耐用性，符合定量检测的需求。

前言

β-丙内酯（β-propiolactone , BPL）是一种杂环化合物，分子式为C3H4O2，相对分子质量72.06，为无色有刺激气味的液体，已被广泛用作多种人用和兽用疫苗的杀菌消毒剂 [1]。BPL可通过与嘌呤碱基反应改变病毒核酸结构，达到灭活病毒的目的[2]。大剂量BPL可致癌，但极易水解，在37 ℃水浴2 h后可水解为无毒的β-羟基丙酸[3]。BPL对病毒抗原破坏作用较小、灭活时间短且极易水解的特性可缩短疫苗生产周期，提高经济效益[4]。

在灭活疫苗生产工艺中使用BPL，需对疫苗原液中的BPL残留量进行检测以确认其符合要求。但由于BPL极易水解，使用高效液相色谱法对其残留量检测时，只能使用纯有机溶剂作为流动相，且检测成本很高[2,5]，而使用气相色谱法可显著降低检测成本。虽然已有气相色谱法检测BPL残留量的报道，但这些检测方法存在检测时间较长[6-8]、线性不好[9]、线性范围跨度大[6-9]等问题。

本研究拟建立准确快速检测BPL残留量的检定方法，并根据中国药典2015年版四部9101药品质量标准分析方法验证指导原则[10]的要求对该方法进行系统（专属性、线性和范围、准确度、精密度、检测限和定量限、耐用性）验证，为灭活疫苗工艺中BPL含量的检测提供更加可靠的方法。

1 材料与方法

1.1 仪器和试剂

1.1.1 仪器 Agilent 7890B型气相色谱仪（FID检测器）购自美国安捷伦公司，移液器购自德国Eppendorf公司。

1.1.2 试剂 氮气（纯度99.99%）购自云南梅塞尔气体有限责任公司。BPL对照品（纯度99.20%）购自德国SERVA公司，批号200312。乙腈（色谱纯）购自美国Fisher Chemical公司，批号184867。10 mmol/L PBS由中国医学科学院医学生物学研究所配制。

1.2 BPL残留量检测方法建立

取1 000 μL供试品于气相色谱样品瓶中，直接进样。检测条件：氮气流速1.0 ml/min；色谱柱为Agilent DB-624毛细管柱（30 m×0.25 mm×1.4 μm)；进样口温度150 ℃；FID检测器温度250℃，尾吹流量40 ml/min；柱温箱温度80 ℃保持2 min，然后以80 ℃/min速率升温至160 ℃保持3.5 min；进样量1 μl；后运行温度80 ℃，运行时间1.5 min；分流比5:1。

1.3 方法验证

为了考察不同实验人员按本文方法进行实验均能得到准确、可靠的实验结果，按中国药典2015年版四部药品质量标准分析方法验证指导原则、残留溶剂测定法及气相色谱法[10]的相关要求，专属性、检测限和定量限、耐用性的验证由1名实验人员完成；系统适应性、线性和范围、准确度和精密度的验证分别由3名实验人员独立完成。

1.3.1 专属性 由于BPL易水解，需采用乙腈稀释对照品后进行系统适应性试验和标准曲线测定，因此在进行专属性验证时需考虑乙腈对专属性的影响。供试品溶液：用10 mmol/L PBS稀释得到的1∶4 000 BPL对照溶液。阳性对照溶液：用乙腈稀释得到的1∶4 000 BPL对照溶液。阴性对照溶液1：10 mmol/L PBS。阴性对照溶液2：乙腈。按1.2的方法对以上样品进行检测，验证BPL峰的专属性。可接受标准：阴性对照溶液无BPL峰，供试品溶液和阳性对照溶液有BPL峰。

1.3.2 系统适应性 以乙腈为空白溶液，以乙腈稀释的1∶32 000 BPL对照溶液为系统适应性样品，按1.2的方法对其进行5次检测，记录色谱峰的峰面积、理论塔板数和分离度，并计算峰面积的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）。可接受标准：BPL峰的理论塔板数不低于5 000，分离度大于1.5且峰面积RSD不大于10%。

1.3.3 线性和范围 用乙腈溶液分别配制稀释比例为1∶32 000、1∶64 000、1∶128 000、1∶256 000、1∶512 000、1∶1024 000的对照溶液，并按1.2的方法进行检测。以BPL对照溶液浓度为x轴，峰面积为y轴进行线性回归分析，建立回归方程，计算回归曲线的决定系数（R2）。可接受标准：回归曲线的R2不小于0.99。

1.3.4 准确度 3名实验人员分别在不同工作日内用乙腈溶液分别配制稀释比例为1∶128 000、1∶256 000、1∶512 000的BPL溶液各3份，按1.2的方法进行检测。计算各浓度BPL测定含量的回收率。可接受标准：各浓度的回收率在80%~115%之间。

1.3.5 精密度

1.3.5.1 重复性 采用1.3.4的数据，计算各浓度样品测定含量的RSD。可接受标准：各浓度的RSD应不大于6%。

1.3.5.2 中间精密度 采用1.3.4的数据，计算3名实验人员检测同一浓度样品测定含量的RSD。可接受标准：3名实验人员的RSD应不超过11%。

1.3.6 检测限和定量限 根据线性和范围结果下最低浓度时BPL峰的信噪比进行计算，得到信噪比为10和3的理论浓度，按此浓度用乙腈对BPL对照品进行逐级稀释（如此稀释浓度得到的BPL峰信噪比不满足10和3的要求，可继续稀释），按1.2的方法进行检测，分析每个稀释比例对应的BPL峰信噪比，将信噪比大于10的最低BPL浓度作为该方法的定量限，将信噪比大于3的最低BPL浓度作为该方法的检测限。

1.3.7 耐用性

1.3.7.1 不同载气流速 改变载气流速（0.9、1.0、1.1 ml/min），按1.2的方法进行检测，记录峰面积、理论塔板数、分离度，并计算峰面积RSD。可接受标准：BPL峰的理论塔板数不低于5 000，分离度大于1.5，峰面积RSD不大于10%。

1.3.7.2 不同乙腈保存时间 1∶32 000 BPL对照溶液各取1 mL于5个样品瓶中，将1.2中方法的后运行设置为31.5 min后上样，对5个样品瓶的样品连续上样至120 min，记录峰面积、理论塔板数、分离度，并计算峰面积RSD。可接受标准：BPL峰的理论塔板数不低于5 000，分离度大于1.5，峰面积RSD不大于10%。

2 结果

2.1 专属性

结果见图1，阳性对照溶液和供试品溶液可见BPL峰，阴性对照溶液无BPL峰，表明该方法具有良好的专属性。

2.2 系统适应性

实验结果显示BPL峰理论塔板数为87 586，分离度10.1，5次进样峰面积RSD值为0.3%，3个参数均符合要求，表明该色谱条件可用于BPL的分离与检测，见图2。

2.3 线性和范围

气相色谱法测定BPL含量标准曲线见图3。经3名实验人员验证，BPL的浓度在1.11~ 35.52 μg/ml范围内时，标准曲线R2分别为0.999 65、0.999 99、0.999 98，均大于0.999，表明该方法在1.11 ~ 35.52 μg/ml范围内均可呈现良好的线性。

2.4 准确度

实验人员A、B、C分别对1∶128 000、1∶256 000、1∶512 000稀释浓度供试品溶液的回收率进行3次检测 (表1)。各浓度对应的回收率在97.3%~106.9%之间，均未超过115%，符合可接受标准，表明该方法具有良好的准确性，结果可靠。有文献报道在1∶200、1∶1 000、1∶8 000 高浓度水平下的加标回收率在95.04% ~116. 86%之间，并未对低浓度时的准确性进行验证，本研究在低浓度时的回收率优于文献报道的高浓度回收率；而其余文献均未对其方法的准确度进行研究[6-8]。

2.5 精密度

2.5.1 重复性 如表1所示，BPL含量RSD范围在0.9%~2.6%之间，均不超过6%，该实验结果符合可接受标准，表明该方法具有良好的重复性。

2.5.2 中间精密度 如表1所示，3名实验人员对同一浓度的BPL溶液进行含量测定RSD值在1.2%~2.4%之间，均小于11%，测定结果符合可接受标准。

2.6 检测限和定量限

BPL浓度分别为0.49、0.37、0.30、0.25 μg/ml时，信噪比分别为11.7、9.0、4.1、未出峰，BPL浓度为0.49 μg/ml时信噪比开始大于10，表明该方法的定量限为0.49 μg/ml。BPL的浓度为0.30 μg/ml时信噪比最接近3，表明该方法的检测限为0.30 μg/ml。

2.7 耐用性

2.7.1 不同载气流速 以不同载气流速进行系统适应性测试，结果显示在不同载气流速下，RSD值在0.3%~0.8%之间、理论塔板数均大于5 000，分离度均大于1.5，表明载气流速的微小变化均能满足测定要求，不影响测定结果（表2）。

2.7.2 不同乙腈保存时间 在乙腈中不同保存时间的BPL检测结果如表3所示，结果显示，在不同乙腈保存时间下BPL峰面积RSD为1.7%，符合标准，表明在低浓度时BPL在乙腈中室温条件下均能保持稳定。

3 讨论

BPL灭活作用强且极易水解，水解产物为人体脂肪代谢产物β-羟基丙酸，对人体无害，且对病毒抗原破坏作用较小且灭活时间短，这些特点使其在灭活疫苗生产工艺中被广泛使用。然而，大剂量的BPL具有致癌的风险，因此必须严格控制灭活疫苗中的BPL含量。检测方法的准确可靠对控制灭活疫苗中的BPL含量尤为重要。

与现有文献报道的BPL检测方法相比，本研究建立的分析方法缩短了检测时间（本研究10 min，文献报道均大于15 min[6-8]），且在低浓度范围内（1.11~ 35.52 μg/ml）下线性良好，R2均大于0.999。本方法的线性系数优于文献报道的0.9994[6]、0.999[7]、0.9991[8]、0.77[9]；并且这些文献报道的线性范围跨度均比较大，而针对检测BPL残留量时，方法在低浓度范围内的线性越好，结果更可靠，因此本研究采用的检测方法用于BPL残留量检测更合理。

经过全面系统的验证，结果显示建立的检测方法专属性良好。系统适应性试验结果显示载气流速的微小变化不影响测定结果，证明该方法系统适应性良好且具有很好的分离效果，能最大程度降低溶剂峰对BPL的影响。此外我们通过3名实验人员独立使用建立的方法检测，对该法的线性和范围、准确度及精密度进行了全面系统的研究，结果显示在1.11~ 35.52 μg/ml范围内，R2均大于0.999；1∶128 000（8.88 μg/ml）、1∶256 000（4.44 μg/ml）、1∶512 000（2.22 μg/ml）3个稀释浓度的BPL含量回收率在97.3 %~106.9 %之间，RSD值在0.9 %~2.6 %之间；表明使用该方法对低浓度的BPL进行检测仍能做到结果准确可靠且重复性良好，重复性与文献报道的1.44%~2.93%相当[8]。该方法具有良好的中间精密度，而文献均未对中间精密度进行研究[6-9]。同时该检测方法具有更低的定量限（0.49 μg/ml），优于文献报道的1. 145 μg/ml[7]，能定量检测出微量的BPL。在方法建立过程中探索了不同流速和乙腈中不同保存时间对实验结果的影响，结果显示BPL峰面积RSD分别为0.3 %~0.8 %和1.7 %，远低于RSD≤10 %的要求，证明该方法具有很好的耐用性，微小变量对检测结果不造成影响。

综上所述，本研究建立的BPL气相色谱检测方法具有更短的检测时间、更高的准确度和精密度、更低的定量限，而且具有很好的重复性，对微量的BPL也能做到准确检测，可为灭活疫苗中的BPL残留量控制提供可靠依据。

参考文献略

本文转自生物制品圈微信号，文章来源于《国际生物制品学杂志》。

文献信息：赵王丽 黄翟 刘杰 唐军 向春梅 何芯雯 王璇 李小艳 杨欢. β-丙内酯残留量检测分析方法的建立及验证[J]. 国际生物制品学杂志, 2021, 44(2): 74-78.

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