陶庆华组揭示胚胎体轴形成决定因子Huluwa蛋白的降解机制

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上世纪初，德国科学家汉斯·斯佩曼(Hans Spemann，1869-1941)和他的学生希尔德·曼戈尔德(Hilde Mangold, 1898-1924)以蝾螈胚胎为研究材料，发现将原肠胚期背侧部分特定组织移植到另一颗胚胎腹侧时，诱导出了完整的胚胎组织结构，称之为第二体轴【1】，因而这部分组织被称为胚胎的“组织中心”(Spemann-Mangold Organizer, SMO)。在脊椎动物早期胚胎发育过程中，SMO的形成是辐射对称的受精卵发育成为具有明显三维结构生命体的一个重要节点事件。“组织中心”的发现及“胚胎诱导”概念的提出，弥合了“镶嵌型”和“调整型”两种竞争性的发育认知理论的分歧，有力地排除了“活力论”对胚胎学研究的影响，是将实验胚胎学带进发育生物学时代的关键进展【2】。因此，解析诱导“组织中心”产生、介导其诱导活性的分子基础是发育生物学领域中的一个百年难题【3】。2018年，清华大学孟安明院士团队和陶庆华教授团队合作发现了一种新的膜蛋白，命名为Huluwa (Hwa)。Hwa可以促进β-catenin蛋白在胚胎背侧稳定表达，诱导“组织中心”的形成，最终组织胚胎产生不对称的三维结构【4】。因而Hwa被认为是脊椎动物胚胎体轴形成中的关键“背方决定因子”（详见BioArt报道：Science突破丨孟安明/陶庆华组合作发现“葫芦娃”基因，解决早期胚胎发育重大问题—专家解读点评）。

关于Hwa在胚胎早期发育过程中的调控以及如何限制Hwa在正确的时间发挥适度的功能尚不清楚。近日，清华大学生命学院陶庆华团队在EMBO Reports杂志上在线发表了胚胎发育“组织中心”诱导因子Hwa的相关研究 Lysosomal degradation of the maternal dorsal determinant Hwa safeguards dorsal body axis formation。该研究工作首次揭示了胚胎发育过程中Hwa蛋白的调控机制。这是该组继2018年11月份与孟安明院士团队合作在Science上发表发现母源因子Hwa的相关研究以来的又一重大进展。

首先，该研究组以非洲爪蛙作为研究模型，发现Hwa蛋白在胚胎发育早期降解迅速，并且这一降解过程可以被溶酶体抑制剂bafilomycinA1（Baf-A1）抑制，而不能被蛋白酶体抑制剂MG132抑制，表明Hwa蛋白的降解在胚胎发育早期是一个受调控的过程，并主要通过溶酶体途径实现。随后，研究人员从Hwa相互作用蛋白中鉴定到了一个E3泛素连接酶ZNRF3，进一步通过免疫共沉淀实验验证了Hwa和ZNRF3蛋白之间的相互作用。在爪蛙胚胎中，研究人员通过反义寡核苷酸（ASO）介导的母源mRNA敲降技术证明了ZNRF3是SMO形成和背侧发育的负调控因子。同时，他们也使用ZNRF3显性负性突变体ZNRF3ΔRING干扰内源ZNRF3蛋白的功能，发现ZNRF3对于SMO形成过程的调控作用依赖于β-catenin蛋白。那么ZNRF3对于SMO形成和体轴建立的调控是否依赖于Hwa？研究人员在Hwa mRNA敲降的胚胎中，过量表达ZNRF3ΔRING，发现其原本的“组织中心”诱导活性消失了，说明ZNRF3对于组织中心形成和胚胎体轴发育的作用依赖于Hwa。

接下来，研究人员对ZNRF3如何调控Hwa蛋白稳定性进行了探索。实验结果显示ZNRF3作为E3连接酶单泛素化Hwa进而促进其降解。表面生物素化和链霉亲和素pull-down实验进一步阐明ZNRF3对Hwa蛋白的泛素化主要发生在细胞质膜上，随后泛素化的Hwa通过endosome/lysosome途径被降解。

最后，研究人员探索了ZNRF3对Hwa的泛素化在胚胎发育中的作用。作者构建了不能被ZNRF3泛素化的突变体形式Hwa10KR。发现野生型Hwa蛋白的“组织中心”诱导活性能被ZNRF3所抑制，而Hwa10KR不能，表明Hwa的“组织中心”诱导活性通过泛素化被ZNRF3抑制，进一步强调了ZNRF3介导的Hwa泛素化降解在组织中心诱导和胚胎体轴形成中的重要性。

综上所述，该研究发现膜定位的E3泛素连接酶ZNRF3是脊椎动物胚胎体轴形成决定因子Hwa的重要负调控因子，首次揭示了Hwa的蛋白降解调控机制。从机制上阐明ZNRF3可以通过单泛素化的形式介导Hwa从细胞膜上的清除，并促进其通过溶酶体途径快速降解。由ZNRF3介导的Hwa负调控对于正确的胚胎发育“组织中心”形成至关重要，防止“组织中心”的过度扩展，保证正常体轴模式的形成。作者认为Hwa相关的研究还有许多有趣的问题值得探索，例如Hwa与经典的Wnt/β-catenin信号有何关系？Hwa在进化上的保守性如何，哺乳动物中是否也存在类似的同源基因？Hwa是否还存在其他形式的翻译后修饰调控？

朱薛辰博士（现工作单位：西湖大学，博士后）和清华大学博士后汪盼为文章的共同第一作者，陶庆华教授为通讯作者。

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参考文献

[1] Spemann, Hans. Nobel Lecture Nobel Lecture, December 12, 1935 https://www.nobelprize.org/prizes/medicine/1935/spemann/lecture/.

[2] Needham, Joseph. A History of Embryology. New York: Abelard-Schuman, 1959. https://embryo.asu.edu/pages/history-embryology-1959-joseph-needham.

[3] Arias, Alfanso Martinez. On the Nature and Function of Organizers. Development (2018) 145 (5): dev159525.

[4] Yan L, Chen J, Zhu XC, Sun JW, Wu XT, Shen WM, Zhang WY, Tao QH*, Meng AM* (2018) Maternal Huluwa Dictates the Embryonic Body Axis through β-catenin in Vertebrates. Science 362(6417). pii: eaat1045. doi: 10.1126/science. aat1045. (* Co-correspondence authors).

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