苗义良/陈振夏团队揭示猪体细胞克隆特异性重编程障碍调控机制

体细胞核移植（somatic cell nuclear transfer, SCNT）技术，也叫克隆技术，是指将体细胞的核移入去核卵母细胞中，使其发生重编程并发育为新的胚胎个体的技术，这是唯一一种能将终端分化的体细胞转变成为具有全能性胚胎的技术。近年来，伴随CRISPR/Cas9基因精确编辑体系的发展，克隆技术在猪分子育种上的应用潜力逐渐显现，一批与优势经济性状和抗病性状相关的克隆猪模型被纷纷创制。此外，由于猪和人类生理结构的相似性，克隆猪模型还可应用于人类器官再造和疾病病理研究，这都反映出猪克隆技术在农业育种和生物医学领域存在巨大的应用前景。非瘟疫情影响下，克隆技术还能应用于地方种、引进种和新培育猪品种的种质资源保存。

不过自克隆羊“多莉”诞生以来，哺乳动物克隆胚胎早期发育的高损率（克隆囊胚率仅10-15%，受精囊胚率可达30-80%）和极低的出生效率（克隆动物约1-2%，受精动物可达40-60%）一直是限制克隆技术推广应用的瓶颈问题。目前的主流观点认为，受体卵母细胞对供体细胞基因组存在天然的重编程障碍,导致克隆胚胎出现表观遗传修饰的异常富集和相应基因的异常表达，而寻找克服重编程障碍的有效方法一直是突破猪克隆技术应用壁垒的研究热点。

2021年10月21日，华中农业大学动科动医学院苗义良团队与生科院陈振夏团队合作在Stem Cell Reports杂志上发表了题为TDG is a pig-specific epigenetic regulator with insensitivity to H3K9 and H3K27 demethylation in nuclear transfer embryos的研究论文，报道了猪克隆胚胎发育过程中组蛋白甲基化H3K9me3、H3K27me3以及DNA甲基化的重编程障碍，以及克服上述重编程障碍并促进猪克隆胚胎发育的两种新方法。

该研究首先利用低细胞量转录组测序（Smart-seq）技术，绘制了猪体内受精胚胎、克隆胚胎和供体成纤维细胞（pig fetal fibroblast, PFF）的转录图谱。通过比对分析，从全基因组层面鉴定了猪克隆胚胎在胚胎基因组激活（embryonic genome activation, EGA）阶段（4细胞期）异常表达的基因和基因组区域，包括胚胎基因组激活失败（EGA-OFF）的基因1230个和基因组区域745个，以及供体细胞记忆擦除失败（PFF-ON）的基因529个和基因组区域589个。

接下来，该研究利用低细胞量染色质免疫共沉淀测序（ULI-NChIP-seq）技术，绘制了克隆胚胎和供体成纤维细胞组蛋白甲基化H3K4me3、H3K9me3、H3K27me3的富集图谱，由此确定了上述异常表达的基因启动子和基因组区域中存在高水平富集的组蛋白甲基化H3K9me3和H3K27me3。最重要的是，针对这些重编程障碍，该研究联合使用显微注射技术在克隆胚胎中过表达H3K9me3的去甲基化酶KDM4A，并向胚胎培养液中添加H3K27me3编写酶抑制剂GSK126，最终清除了4细胞胚胎H3K9me3和H3K27me3的异常富集，调整了猪克隆胚胎异常表达的基因和基因组区域，并最终使克隆胚胎的囊胚率提高近两倍。

研究人员意外发现了一个猪胚胎基因组激活阶段特异表达的因子——胸腺嘧啶糖基化酶TDG，该因子参与DNA主动去甲基化。有趣的是，上述清除异常组蛋白甲基化的方法并未激活TDG的表达。该研究随后利用低细胞量全基因组DNA甲基化测序（PBAT-seq）技术，确定了异常表达的基因启动子和基因组区域中存在高水平富集的DNA甲基化。而使用诱导表达TDG的供体细胞株构建克隆胚胎可以显著降低4细胞胚胎的DNA甲基化水平，并提高了其囊胚发育能力。

猪克隆胚胎在胚胎基因组激活阶段的重编程障碍和克服途径

总之，该研究旨在降低猪克隆胚胎早期发育的高损率，从而推动克隆技术更快更高效地运用于克隆猪模型的规模化生产。这不仅拓展了哺乳动物胚胎早期发育阶段重编程障碍的发生机制，也为克隆技术在促进其他家畜动物、非人灵长类动物和宠物等方面提供了新的参考方案。

华中农业大学动科动医学院苗义良教授和生科院陈振夏教授为本文共同通讯作者。华中农业大学动科动医学院副研究员刘鑫和王涛博士、生命科学技术学院陈露博士后为本文的共同第一作者。

原文链接：

https://www.cell.com/stem-cell-reports/fulltext/S2213-6711(21)00489-6

制版人：十一

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