《Science子刊》可见光交联的载有蛇提取物的止血生物粘附凝胶

【摘要】

生物粘合剂可减少手术时间和手术并发症。 然而，在有血液的情况下，粘附强度通常会受到影响。受蛇毒凝血活性的启发，加拿大曼尼托巴大学Malcolm Xing（译：马尔科姆·邢）教授，与第三军医大学Rixing Zhan博士/罗高兴教授团队团队报告了一种可见光诱导的抗血止血粘合剂 (HAD)，其中含有甲基丙烯酰明胶和爬虫酶，这是一种从 Bothrops atrox 中提取的血凝酶 (HC)。

HAD 导致血小板的活化和聚集，并有效地将纤维蛋白原转化为纤维蛋白，从而实现快速止血和封闭组织。HAD 的凝血时间约为 45 秒，而没有 HAD 的凝血时间为 5 至 6 分钟。HAD 立即在肝脏切口（~45 秒）和切鼠尾（~34 秒）上实现止血，并分别减少了 79% 和 78% 的失血量。HAD 在密封严重受损的肝脏和腹主动脉方面也很有效。有通过结合止血和粘合剂来桥接受伤组织的巨大潜力。相关论文以题为Snake extract–laden hemostatic bioadhesive gel cross-linked by visible light发表在《Science Advances》上。

【主图导读】

HAD的制备和表征

可见光交联粘合剂是由光敏剂曙红 Y 激活的 GelMA 上的 MA 侧基的光化学反应形成的。反应机理如图 1A 所示。当暴露在可见光下时，HAD 的交联可以在曙红 Y、TEA 和 VC 的帮助下通过自由基聚合实现。图 1B 显示了响应 60 秒可见光曝光的 HAD 凝胶形成的数字图像。图 1C 显示了所有组分的紫外-可见 (UV-vis) 吸收光谱。随着反应的进行，红色曙红Y变得几乎无色，在450～550nm处吸收能力下降。如图 1D 所示，随着光照时间的增加，从 430 到 550 nm 的吸收逐渐下降。扫描电子显微镜（SEM）（图 1，E 和 F）表明 GelMA 和 HAD 的微观结构清晰，壁光滑，多孔，平均孔径约为 50 μm，这表明 HC 的存在不影响原始的 GelMA 结构。

图 1 HAD 的制备和表征。(A) 可见光诱导的光聚合系统的示意图。(B) 在可见光照射之前（顶部）、期间（中间）和之后（底部）的 HAD 胶凝转变的数码照片。(C) TEA、VC、HC、GelMA、曙红 Y、GelMA 预聚物和 HAD 预聚物的 UV-vis 吸收光谱。(D) 照射 0、20、40 和 60 秒后 HAD 的紫外可见吸收光谱。(E 和 F) 分别为 GelMA 和 HAD 的 SEM 图像。

HAD的机械性能

在HAD上进行流变测试以监测胶凝过程。从动态时间扫描（图 2A）来看，在曝光前储能模量 G' 低于损耗模量 G"，但随着光照时间的增加，G' 值在 30 秒时超过 G"，证实了不可逆凝胶化 (33)。如图 2B 所示，当应变大于 274% 时，G" 高于 G'，表明凝胶坍塌。振荡频率测试表明粘合剂在 0.1 到100 rad/s条件下是稳定的（图 2C）。

图3 HAD的体外止血性能。(A) 通过血浆凝固动力学选择要掺入 GelMA 的 HC 量。(B) 血浆凝固动力学曲线线性区域的斜率（凝固率）。(C) 包含在 HAD 中的 HC 的释放。(D) 作为控制时间函数的凝块形成、HC、GelMA、HAD 和纤维蛋白胶。(E) 定量凝血时间。(F 到 H) 全血与 GelMA 接触的 SEM 图像分别为 1、2 和 3 分钟。（I 到 K）全血与 HAD 接触的 SEM 图像分别为 1、2 和 3 分钟。

图4 HAD在大鼠截尾模型中的止血性能。(A) 大鼠尾出血止血模型建立示意图。(B) 鼠尾模型中的止血测试过程。(C) 不同治疗的定性出血图像。(D 和 E) 分别是失血和止血时间。

图 5 不同处理的皮肤伤口闭合。(A) 皮肤切口示意图。(B) 第 0、3、5 和 20 天（D0、D3、D5 和 D20）的切口照片。(C) 第 5 天和第 20 天伤口的 H&E 染色。

图6 HAD在肝损伤中的止血特性。(A) 建立大鼠肝脏止血和止血的示意图。(B) 肝损伤检测过程。(C) 用纱布治疗肝损伤。(D) 肝脏的时程出血图像。(E 和 F) 止血时间和失血量。(G) 第 5 天伤口的 H&E 染色。

图 7 对严重损伤肝脏的止血作用。(A) 止血过程的示意图。(B) 在严重肝伤口模型中使用 HAD 的止血测试过程。(C) GelMA 在严重肝伤口模型中的止血测试过程。(D) 作为对照组的未经处理的伤口。

图8 HAD对大鼠腹主动脉损伤模型的止血作用。(A) 大鼠腹主动脉损伤模型建立及密封示意图。(B) HAD大鼠腹主动脉损伤模型的止血和密封试验。(C) GelMA 大鼠腹主动脉损伤模型的止血和密封试验。(D) 由 HAD 密封的腹主动脉的外表面图像。(E) 由 HAD 密封的腹主动脉的内表面图像。(F 和 G) HAD 密封腹主动脉受到大的弯曲和扭曲。(H) HAD 和腹主动脉之间界面的 SEM。

图9 体内止血表面和界面的SEM研究。(A-C) SEM 观察区域示意图。SEM观察区域I如(A1)和(A2)所示；SEM观察区II如(B1)和(B2)所示；SEM观察区域III如(C)所示。（A1 和 A3）GelMA 组止血后外部血凝块的 SEM。（A2 和 A4）HAD 组止血后外部血凝块的 SEM。(B1) 出血肝脏和 GelMA 之间内部界面的 SEM (白色箭头)。(B2) 出血肝脏和 HAD 之间内部界面的 SEM (白色箭头)。(C1) 内部伤口的 SEM。

图 10 经 HAD 处理的大鼠肝脏中血凝块的 SEM。(A)SEM 观察区域的图示。(B)所示的SEM观察区域I；(C)和(D)所示的SEM观察区II；(E)～(J)所示的SEM观察区域III。(B) 纤维蛋白和红细胞相互作用的 SEM。(C 和 D) 内部凝块的 SEM 图像。(E 到 G) 30 秒和 1 分钟和 2 分钟时肝脏出血的 RBC SEM。(H) 血小板拉动和弯曲纤维蛋白纤维以产生收缩应力并导致凝块收缩。(I)血小板变形形成致密结构。(J) 内部收缩的血小板形成了一个紧密堆积的、镶嵌的压缩多面体阵列，形成了一个对止血很重要的致密屏障。(K) 凝块体积随时间收缩的凝块收缩过程。

【总结】

该团队结果强烈表明，HAD 可以是一种有效的止血组织粘合剂/密封剂，尤其是在不可压缩的出血组织中，例如导致相当大死亡率的弥漫性创伤性大出血和动脉出血。从组织穿透的角度来看，可见光诱导的交联系统可以达到 2.5 mm 的厚度。这有利于治疗可触及的厚伤口，因为 HC 的受控释放甚至可以进一步扩散并诱导止血，这已在严重受伤的肝脏模型中得到证实。此外，可见光可交联的 HAD 系统也可能是直接应用于具有广泛出血的更深组织损伤模型的有价值的候选者，应在未来的研究中予以考虑。HAD在不同组织器官中的可控降解率也值得未来研究。

参考文献：

Science Advances 14 Jul 2021:

Vol. 7, no. 29, eabf9635

DOI: 10.1126/sciadv.abf9635

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