细胞焦亡“打孔小分队”：GSDMD如何在膜上打孔？

撰文 | 十一月

细胞焦亡（Pyroptosis）是由炎症小体和下游的效应因子gasdermin D（GSDMD）所介导的【1,2】。在被炎性小体相关半胱天冬酶（Inflammasome-associated caspases）裂解后，GSDMD的N端结构域形成促进细胞溶解的膜孔。有许多蛋白质促进GSDMD的切割，但目前尚不清楚哪种蛋白质是GSDMD分裂后形成膜孔所必需的。

为了揭开这一问题的答案，2021年7月20日，美国波士顿儿童医院和哈佛医学院Jonathan C. Kagan研究组与Charles L. Evavold（第一作者）合作发文题为Control of gasdermin D oligomerization and pyroptosis by the Ragulator-Rag-mTORC1 pathway，通过正向遗传学筛选鉴定发现了Ragulator-Rag-mTORC1信号通路调节GSDMD寡聚化以及参与细胞焦亡的具体分子机制。

目前为止，有两种已知的机制解释了GSDMD膜孔形成和炎症反应。第一种机制涉及炎症小体的作用，炎症小体是超分子组织中心，作为caspase-1激活的亚细胞位点【3】。caspase-1是静止细胞中的一种休眠酶。在感染或细胞稳态被选择性破坏时，炎症小体在细胞质中组装，招募和激活caspase-1。caspase-1将GSDMD切割形成两个片段，N端片段聚合并插入质膜，形成内径10-20nm的孔隙【4】。第二种诱导焦亡的方法是通过小鼠caspase-11或人类caspase-4和caspase-5的作用。这些caspases的催化活性不是通过招募到炎性小体进行激活的，而是通过与细胞脂多糖（Lipopolysaccharides，LPS）相结合而激发的。与LPS结合后，活化后的caspase-11以类似于caspase-1的方式切割GSDMD，导致孔隙形成和焦亡的发生【5】。尽管GSDMD在焦亡中具有重要作用，但调节其活性机制的研究主要集中对其在影响其切割的上游因子上。但是在GSDMD切割后，是否存在促进质膜孔形成的因素尚不清楚。

图1 GSDMD切割后N端表达的调控因子筛选系统

为了鉴定找到促进在GSDMD切割后促进核孔形成以及焦亡的因子，作者们构建了一种遗传筛选系统。该系统利用了GSDMD的N端单独表达就足以诱发凋亡这一现象【1,2】，从而能够避免上游诱导细胞凋亡产生的事件。作者们在永生化的小鼠骨髓源性巨噬细胞（immortalized bone-marrow-derived macrophages，iBMDMs）中稳定表达了转录激活因子，能够分别诱导N端以及全长的GSDMD的转基因表达。作者们发现在细胞中分别诱导N端以及全长的GSDMD表达后，只有N端而非全长的GSDMD可以导致膜穿透性染料碘化丙啶（Propidium iodide）的渗入以及乳酸脱氢酶（Lactate dehydrogenase，LDH）的释放。LDH只有在细胞裂解后才能够释放【6】。由此，作者们建立起了一种能够独立于炎症小体直接诱导GSDMD膜孔形成活性的实验系统，从而能够特异性识别介导该过程的调节因子。

为了找到调节GSDMD孔隙形成的关键因子，作者们利用前面介绍的系统进行了一个全基因组CRISPR-Cas9为基础的筛选。从该筛选中作者们鉴定发现了与mTOR调控相关的复合体Ragulator-Rag（图2）。为了证明筛选到的Ragulator-Rag复合体的确参与到GSDMD孔隙形成过程中，作者们对复合体中的不同组分进行了遗传删除。作者们发现，其中RagA删除的细胞中碘化丙啶入核明显降低。这些结果说明Ragulator-Rag复合体对于GSDMD介导的孔隙形成以及细胞焦亡非常关键。

图2 Ragulator-Rag复合物

Ragulator-Rag复合体对mTOR信号具有非常关键的调控作用，因此作者们想知道mTOR是否也参与到GSDMD的N端介导的孔隙形成过程中。作者们发现，mTOR的活性的确为GSDMD介导的孔隙形成所必须，而且mTORC1而非mTORC2参与到细胞焦亡之中。

那么，Ragulator-Rag-mTORC1信号通路是如何调节GSDMD介导的膜孔形成的呢？作者们进行了Ragulator-Rag组分的敲除，并对GSDMD切割后活性发挥膜定位以及寡聚化这两个主要的步骤进行了检测。作者们发现，RagA或者RagC的敲除并不会影响GSDMD在膜上的定位，但是确会显著地影响GSDMD的寡聚化。进一步地，为了建立Ragulator-Rag复合体与GSDMD寡聚化之间的联系，作者们考虑将孔隙形成与线粒体活性破坏【7】这一现象进行联系。为此，作者们使用MitoTracker以及电位染料对GSDMD的N端所介导的核孔形成后对线粒体活性的影响进行检测。作者们发现，线粒体活性以及与之相关的ROS均会介导GSDMD的寡聚化。因此，线粒体的健康和ROS的产生促进了GSDMD的寡聚化和膜孔的形成。

图2 工作模型

总的来说，该工作建立了一种能够对细胞焦亡过程中GSDMD介导的膜孔形成的因子进行筛选的实验系统，并且通过正向遗传学筛选鉴定发现了Ragulator-Rag-mTORC1通路对于膜孔形成过程的关键作用，同时探明Ragulator-Rag复合体是通过调控GSDMD的寡聚化而非膜定位从而揭开了其作用的具体分子机制。

值得一提的是，2021年6月25日，来自中科院上海巴斯德研究所的刘星研究员团队与美国哈佛大学医学院Judy Lieberman教授团队在 Science 杂志发表题为The lysosomal Rag-Ragulator complex licenses RIPK1- and Caspase-8-mediated pyroptosis by Yersinia的论文，报道了通过CRISPR/Cas9全基因组敲除筛选鉴定出耶尔森菌感染并触发细胞焦亡的关键因子——Rag-Ragulator复合物，并揭示该复合物激活FADD-RIPK1-Caspase-8（complex Ⅱ）的分子机理（Science丨刘星团队等揭示耶尔森菌诱导细胞焦亡关键机制）。

上述两篇类似的工作共同鉴定到了Ragulator-Rag复合体对细胞焦亡的调控。

原文链接：

https://doi.org/10.1016/j.cell.2021.06.028

参考文献

1 Kayagaki, N. et al. Caspase-11 cleaves gasdermin D for non-canonical inflammasome signalling. Nature 526, 666-671, doi:10.1038/nature15541 (2015).

2 Shi, J. et al. Cleavage of GSDMD by inflammatory caspases determines pyroptotic cell death. Nature 526, 660-665, doi:10.1038/nature15514 (2015).

3 Chan, A. H. & Schroder, K. Inflammasome signaling and regulation of interleukin-1 family cytokines. The Journal of experimental medicine 217, doi:10.1084/jem.20190314 (2020).

4 Ding, J. et al. Pore-forming activity and structural autoinhibition of the gasdermin family. Nature 535, 111-116, doi:10.1038/nature18590 (2016).

5 Aglietti, R. A. et al. GsdmD p30 elicited by caspase-11 during pyroptosis forms pores in membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 113, 7858-7863, doi:10.1073/pnas.1607769113 (2016).

6 Evavold, C. L. et al. The Pore-Forming Protein Gasdermin D Regulates Interleukin-1 Secretion from Living Macrophages. Immunity 48, 35-44.e36, doi:10.1016/j.immuni.2017.11.013 (2018).

7 de Vasconcelos, N. M., Van Opdenbosch, N., Van Gorp, H., Parthoens, E. & Lamkanfi, M. Single-cell analysis of pyroptosis dynamics reveals conserved GSDMD-mediated subcellular events that precede plasma membrane rupture. Cell death and differentiation 26, 146-161, doi:10.1038/s41418-018-0106-7 (2019).