如何让CRISPR更安全？大自然设计了一套天然工具

▎药明康德内容团队编辑

上周末，由2020年诺贝尔化学奖得主Jennifer Doudna教授联合创建的Intellia Therapeutics公司和再生元（Regeneron）联合宣布，在研体内CRISPR基因编辑疗法NTLA-2001在1期临床试验中获得积极结果。初步结果显示，单剂静脉输注NTLA-2001可以将患者体内的致病蛋白转甲状腺素蛋白水平（TTR）平均降低87%。这是首个支持在人体内使用CRISPR基因编辑的安全性和效果的临床数据，被誉为CRISPR基因编辑领域的

图片来源：123RF

CRISPR基因编辑系统被人称为“基因魔剪”，它能够对基因组中几乎任何序列进行特异性的编辑。然而，将这一系统用于治疗人类疾病需要解决的关键性问题之一是它的安全性。如果CRISPR系统对体内不该编辑的DNA序列进行了编辑，可能引入基因变异，导致细胞癌变等不良后果。这就是人们常说的“脱靶效应”。在体内进行基因编辑对CRISPR系统的安全性提出了更高的要求，因为在体外进行基因编辑之后，我们还可以对改造的细胞进行检查，发现可能出现的脱靶基因编辑。而将CRISPR基因编辑系统输入到人体内之后，控制它们活性的手段有限，检验是否产生脱靶编辑也更为困难。

不过，大自然在提供给我们CRISPR基因编辑系统的同时，也提供了控制它活性的工具。近日，美国化学会旗下C&EN网站上的一篇文章对这类工具进行了介绍，它们叫做抗CRISPR蛋白（anti-CRISPR，Acr）。

CRISPR基因编辑和抗CRISPR蛋白：细菌和病毒之间的“军备竞赛”

熟悉CRISPR基因编辑系统的读者可能知道这一系统的发现源于对细菌的研究。科学家们在细菌中发现独特的CRISPR序列，而这些CRISPR序列具有和人类的免疫系统非常相似的功能。它们来自侵入细菌的病毒和噬菌体（一类专门以细菌为食的病毒），细菌通过CRISPR序列“记住”曾经入侵的病毒，当它们再次入侵时，CRISPR序列会引导Cas9酶切碎这些序列，抵抗病毒的感染。

然而，自然选择让细菌演化出了抵抗病毒入侵的CRISPR系统，也让病毒演化出了抵抗CRISPR系统的手段。科学家们对噬菌体的研究发现，很多噬菌体的基因序列中编码着不同类型的抗CRISPR蛋白。这些与细菌的“军备竞赛”中生成的蛋白通常为由50-150个氨基酸构成的小蛋白，虽然在结构和序列上并没有很多相似性，但是它们都有一个共同的目标——抑制CRISPR系统的作用。

抗CRISPR蛋白的多种作用机制

抗CRISPR蛋白的作用机制虽然多种多样，但是主要可以分为两大类。一类是阻止Cas酶与靶点DNA序列的结合：例如AcrIIA4（下图红色圆形）能够与Cas9酶识别靶点DNA序列的蛋白域结合，而AcrIIC3（蓝色方块）能够促使Cas9酶形成二聚体，让它们无法与靶点DNA序列结合。AcrVA1（黄色）则能够切割Cas12a酶用于辅助靶点识别的RNA序列。

另一类作用机制是直接抑制Cas酶的DNA切割活性：例如AcrIIC1（橙色三角）能够通过与核酸酶蛋白域结合抑制Cas9的活性。

▲CRISPR基因编辑系统介导的免疫力（a）和抗CRISPR蛋白的多种作用方式（图片来源：参考资料[2]）

这些多种多样的作用机制为科学家们提供了一套丰富的工具来调控CRISPR基因编辑系统的活性。

抗CRISPR蛋白的广阔应用前景

控制CRISPR系统的安全性无疑是推广CRISPR临床应用需要解决的重要问题之一，因此科学家们也在开发多种方法来提高CRISPR基因编辑的安全性，其中包括开发小分子抑制剂和对Cas酶进行改造，让它们可以接受光或者其它手段的调控。与这些手段相比，2020年发表在Nature Methods上的综述指出，抗CRISPR蛋白具有以下几个优点：

• 具有广谱效应：很多Acr蛋白能够抑制多种Cas酶，这种广谱的活性意味着它们可以用于调节不同种天然和通过基因工程改造的CRISPR-Cas基因编辑系统。

• 具有多变的调节模式和特异性：目前已经发现了多种靶向同一Cas酶的Acr蛋白。它们有不同的大小，不同的抑制强度，以及不同的作用方式。因此，根据需求，研究人员可以筛选特定的Acr，或对它们进行进一步优化来达成对CRISPR系统的特异性调节。

• 容易使用：使用标准的分子生物学手段，Acr蛋白可以多种体外和体内系统中表达。编码这些Acr蛋白的基因序列可以与编码CRISPR-Cas系统的序列使用同样的载体递送到患者体内。

目前，已经有多家生物技术公司在开发基于Acr蛋白的CRISPR-Cas基因调控工具，除了降低基因编辑系统的脱靶效应以外，它还可以用于在时间和空间维度调控基因编辑的活性。

▲Jennifer Doudna教授（图片来源：The Royal Society, CC BY-SA 3.0 , via Wikimedia Commons）

“很显然，我们需要研究如何真正控制这些基因编辑系统，让我们确保只在想要的地方做出改变。”Jennifer Doudna教授在2020年接受《自然》杂志访谈中表示，CRISPR-Cas系统将带来生物科技的革命，同时，抗CRISPR蛋白的发现可能为研究人员提供急需的纠正工具，让CRISPR基因编辑系统更为安全。

参考资料：

[1] Anti-CRISPR proteins could help put the brakes on gene editing. Retrieved June 21, 2021, from https://cen.acs.org/biological-chemistry/gene-editing/Anti-CRISPR-proteins-help-put/99/i21

[2] Marino et al., (2021). Anti-CRISPR protein applications: natural brakes for CRISPR-Cas technologies. Nature Methods, https://doi.org/10.1038/s41592-020-0771-6

[3] The kill-switch for CRISPR that could make gene-editing safer. Retrieved June 27, 2021, from https://www.nature.com/articles/d41586-020-00053-0

注：本文旨在介绍医药健康研究进展，不是治疗方案推荐。如需获得治疗方案指导，请前往正规医院就诊。