系统总结丨基因编辑技术与灵长类类器官在生物医学研究中的应用

随着干细胞领域的蓬勃发展，指向临床的干细胞治疗策略展现出巨大的研究潜力。过去的十年间，一项新型技术正是基于干细胞研究的进步而在临床转化研究中大放异彩——类器官。类器官是利用多能干细胞（pluripotent stem cells, PSCs）或器官特异性祖细胞（adult stem cells, ASCs）在体外自组装成三维细胞团，从而模拟体内相应器官的结构和功能【1】。由于具有更复杂的结构，类器官既能比传统的干细胞更全面地反映体内的发育过程，又能比使用动物建立疾病模型更容易。另一方面，基因编辑技术，尤其是CRISPR技术，赋予了人类精确操控DNA序列的能力，为生物医学领域提供了从根本上治疗遗传疾病的新策略。两种技术相辅相成，利用灵长类干细胞在体外构建类器官疾病模型，并利用基因编辑技术修正致病基因，将会极大地推动干细胞研究的临床转化和个体医疗的发展。

2021年4月30日，昆明理工大学的牛昱宇教授、季维智院士和陈传鑫博士在Trends in Biotechnology杂志上发表综述，对目前基因编辑技术和灵长类类器官在生物医学研究的应用进行了总结。

构建灵长类类器官的新方法

利用离体细胞的自组装在体外形成细胞团最早可以追溯到20世纪初，然而直到2009年类器官研究才开始彰显活力。该领域的长期低迷主要是因为缺乏高效的类器官构建方法。得益于Hans Clevers的突破性工作，他们利用Matrigel来提供支持细胞组装和生长的3D基质，帮助肠类器官的形成。他们的方法迅速得到借鉴，成功用于各种类器官的构建。然而，尽管Matrigel极大地推动了类器官领域的发展，但这种动物衍生产品含有许多未知的组分，对用于人的临床实验来说始终有潜在的不安因素。

类器官的应用往往受制于较低的可重复性和难以获得成熟的样品，近年来，得益于新型生物材料和共培养技术的发展，科学家们摸索出了解决这两个问题的方法。一方面，人们开发了如聚乙二醇（PEG）等材料的化学限定水凝胶来替代Matrigel，推动了类器官构建的工业化标准建立；另一方面，为了促进类器官成熟，人们将内皮细胞、血管细胞、免疫细胞以及神经细胞等和干细胞共同培养，构建出具有多层复杂的类器官，更好地模拟体内器官的真实情况。总的来说，如何构建成分已知、容易重复、发育成熟的类器官以实现临床转化是该领域技术发展的方向。

灵长类类器官：连接动物模型与人类的桥梁

由于人类和其他动物的物种差异，许多在非灵长类动物模型中取得的成果不能很好地转化到临床实验中，因此非人灵长类类器官模型就能作为联系非灵长类动物模型和人类的纽带和桥梁，补充我们在非灵长类模型中无法获得的信息，解决研究结果临床转化的问题（图1）。值得注意的是，尽管我们已经能将人类胚胎在体外发育到原条阶段，但由于伦理的限制，无法获得更进一步的发育信息；然而，Niu等人通过非人灵长类细胞的体外延时培养技术，实现了14天限制的突破，为非人灵长类类器官的构建打下了基础【2】。另一方面，在小鼠中类原肠胚（gastruloids）和类囊胚（blastoids）的发展，为灵长类类器官的研究提供了思路。总的来说，非人灵长类类器官由于能够突破如今的伦理限制，又和人类具有更高的相似性，在临床转化研究中具有极大的潜力。而如今类器官技术上的积累也提高了人们对编辑和调控类器官手段的需求。

Ji等人采用TALENs和CRISPR等基因编辑技术构建了多种基因工程猴疾病模型，如杜氏肌营养不良（DMD）、先天性肾上腺发育不全和性腺激素性腺功能减退（AHC-HH）和早衰症模型【3-5】。该课题组不仅实现了猴模型中的基因敲入和敲除，也证实了诸如碱基编辑技术（base editing, BE）等新型的基因编辑技术在猴模型中应用的可行性。他们的工作为非人灵长类类器官的基因编辑应用铺平了道路。

图1 灵长类类器官是联系动物模型和人类的桥梁

基因编辑灵长类类器官研究发育过程

我们对发育过程的认识促进了我们对类器官形成的认识，而类器官的研究又能反哺我们对器官生成和发育的理解。利用基因编辑技术，在体外对类器官进行功能获得或缺失实验能帮助我们识别出发育过程的内在机理，而不用顾虑由于基因改变而造成的个体致死效应。

Wnt信号通路是正常发育和肿瘤形成过程中的重要通路。APC失活是Wnt信号通路中的重要事件，Liu等人利用CRISPR的方法构建了APC敲除（APCKO）的类器官，成功复现了人体中Wnt通路异常激活情况下的肿瘤表型【6】。除了直接改变Wnt信号通路的基因，也可以通过编辑通路外的基因以实现对Wnt通路的调控。采用CRISPR/Cas9介导的基因突变，Sato等人在肿瘤类器官中发现了CDKN2A和TP53的突变能够抵抗Wnt异常激活而引起的细胞凋亡，揭示了肿瘤生成过程中的环境适应过程【7】。更进一步，Spit等人在结肠类器官中通过CRISPR介导的基因编辑，发现了TP53的突变会引起致癌基因RNF43的异常表达，指出这种异常表达会导致结肠类器官丧失对Wnt通路的敏感性而产生非Wnt依赖性的生长【8】，解释了Sato等人发现的适应过程。此外，利用CRISPR构建的NKX2.1+报告细胞系，McCauley等人构建了人气管类器官，证实了Wnt通路是气管极性形成的关键调控通路【9】。

可以看出，利用基因编辑技术，科学家们能够针对特定的细胞类型、基因或通路，在类器官中重现正常或非正常发育过程中的内在分子机理。

基因编辑在灵长类类器官疾病模型中的应用

利用CRISPR等基因编辑手段对特定基因进行突变，能够构建多种人类疾病的类器官模型。Bian等人详细描述了如何利用CRISPR介导的基因突变构建脑肿瘤模型的方法：他们将4种基因元件——转座系统，GFP示踪元件，致癌基因的过表达组件和带有靶向抑癌基因的gRNA的Cas9核酸酶——共同导入类器官，这样就能依据研究需要自由获得致癌基因的功能缺失或功能获得突变。通过将临床上已知的异常基因进行过表达或沉默，他们成功获得了脑肿瘤类器官，并对其该模型的转录组和肿瘤-正常组织交互作用进行了分析，这些类器官也为筛选脑肿瘤治疗药物提供了重要平台【10】。这种方法理论上可以适用于任何种类的类器官疾病模型的构建。除了传统的CRISPR方法，BE系统在小鼠类器官上的应用也彰显出其在人类类器官模型上应用的潜在可能【11】。

正如Bian等人的研究提到，类器官疾病模型可以用于筛选传统药物。同样地，这些类器官模型也能用于评价基因治疗的疗效。美国NIH曾报道过一项概念验证性的研究，他们将利用CRISPR/Cas9构建的人GM1神经节苷脂沉积症脑类器官作为对象，注入带有GLB1基因的AAV9，成功缓解了疾病症状【12】。

事实证明，利用基因编辑技术将关键的致病基因进行过表达或突变，不仅可以构建类器官疾病模型，方便对病理表现和致病机理进行研究，还可以作为针对某种特定突变的药物筛选平台，有目的性地对基因治疗的效果进行评价。

基因编辑在生物信息库和个体医疗中的应用

生物信息库（biobanking）是类器官模型快速发展的产物，它是一个包含了某种疾病中所有基因突变的人类类器官库。人们最早的时候只能依靠收集病人的部分肿瘤组织来获取原始肿瘤的信息，而随后利用类器官技术，Hans Clevers等人从20位结肠直肠癌（CRC）患者中建立了“CRC病人类器官信息库”，其中包含了所有的CRC肿瘤和周边健康组织的基因信息【13】。如今，生物信息库已经用于收集诸如肾病和恶性胶质瘤等多种疾病的信息，为未来的药物筛选和治疗开发提供了丰富的参考信息。

生物信息库中蕴含了丰富的基因信息，是基因编辑修正致病突变的完美试验场。Huang等人在视网膜类器官信息库中对比了传统CRISPR/Cas9和BE修正特定突变的效率，他们发现约传统的CRISPR基因编辑方法能够达到20-50%的修复效率，但在未修复的细胞中却存在脱靶现象；而BE体系能够实现超过50%的修复效率，并且没有任何脱靶现象【14】。同样地，Clevers等人也在包含664位病人的类器官信息库中对比了两种ABE体系，没有发现任何脱靶现象【15】。他们的工作都证实了BE体系作为精确高效的基因编辑手段，在临床实验中具有良好的前景，另一方面Clevers等人的研究也验证了大规模的生物信息库对于检验治疗手段的安全性也具有一定可行性。

由于个体之间存在一定差异，同样的药物和治疗手段对不同个体往往有不同的治疗效果，而这种差异很难通过动物模型来反映出来。然而，由于生物信息库收集了病人的病患组织和健康组织的全部信息，因此可以用来对比药物和治疗对于不同来源的类器官的作用效果，对比病人-病人之间、病变组织-健康组织之间的不同反映，开发针对个体差异的精确治疗办法（如图2）。目前许多课题组正在扩充多个疾病类器官模型库的转录组【16】、蛋白组【17】和治疗响应【18】的信息，为实现精确的个体医疗提供帮助。

图2 类器官在个体医疗上的应用

展 望

在未来，灵长类类器官将会作为临床转化的前置平台，为临床实验提供关键的信息，如今的COVID-19疫情已经证实了类器官能够迅速将实验成果进行转化【19】；基因编辑技术，特别是精确的点编辑技术会极大地推动灵长类类器官的在模型构建和基因治疗的应用。然而，我们也应该意识到，人类类器官的操纵同样应该考虑严格的伦理限制【20】，而非人灵长类类器官由于在伦理上更容易被接受，也更容易进行体内研究，对未来疾病类器官的研究具有更大的价值。总体而言，虽然类器官无法替代动物模型，但它将成为连接非灵长类动物研究和人类临床实验的桥梁，推动实验室研究到临床的结果转化。

原文链接：

https://www.cell.com/trends/biotechnology/fulltext/S0167-7799(21)00085-8

参考文献

1 Lancaster, A.M. et al. (2014) Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345, 1247125

2 Niu, Y. et al. (2019) Dissecting primate early post-implantation development using long-term in vitro embryo culture. Science. 837, eaaw5754

3 Wang, F. et al. (2020) Generation of a Hutchinson-Gilford progeria syndrome monkey model by base editing. Protein Cell DOI: 10.1007/s13238-020-00740-8

4 Chen, Y. et al. (2015) Functional disruption of the dystrophin gene in rhesus monkey using CRISPR/Cas9. Hum. Mol. Genet. 24, 3764–3774

5 Kang, Y. et al. (2015) CRISPR/Cas9-mediated Dax1 knockout in the monkey recapitulates human AHC-HH. Hum. Mol. Genet. 24, 7255–7264

6 Liu, X. et al. (2018) Modeling Wnt signaling by CRISPR-Cas9 genome editing recapitulates neoplasia in human Barrett epithelial organoids. Cancer Lett. 436, 109–118

7 Seino, T. et al. (2018) Human pancreatic tumor organoids reveal loss of stem cell niche factor dependence during disease progression. Cell Stem Cell 22, 454-467.e6

8 Spit, M. et al. (2020) RNF43 truncations trap CK1 to drive niche-independent self-renewal in cancer. EMBO 39, e103932

9 Mccauley, K.B. et al. (2017) Efficient Derivation of Functional Human Airway Epithelium from Pluripotent Stem Cells via Temporal Regulation of Wnt Signaling Article Efficient Derivation of Functional Human Airway Epithelium from Pluripotent Stem Cells via Temporal Regulation of Wnt S. Cell Stem Cell 20, 844-857.e6

10 Bian, S. et al. (2019) Genetically engineered cerebral organoids model brain tumour formation. Nat. Methods 15, 631–639

11 Zafra, M.P. et al. (2019) Optimized base editors enable efficient editing in cells, organoids and mice. Nat. Biotechnol. 36, 888–893

12 Latour, Y.L. et al. (2019) Human GLB1 knockout cerebral organoids : A model system for testing AAV9-mediated GLB1 gene therapy for reducing GM1 ganglioside storage in GM1 gangliosidosis. Mol. Genet. Metab. Reports 21, 100513

13 Wetering, M. Van De et al. (2015) Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell 161, 933–945

14 Huang, K. et al. (2019) Morphological and molecular defects in human three-dimensinoal retinal organoid model of X-linked juvenile retinoschisis. Stem Cell Reports 13, 906–923

15 Geurts, M.H. et al. (2020) CRISPR-based adenine editors correct nonsense mutations in a cystic fibrosis organoid biobank. Cell Stem Cell 26, 503-510.e7

16 Vlachogiannis, G. et al. (2018) Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science. 359, 920–926

17 Wetering, M. Van De et al. (2017) Personalized proteome profiles of healthy and tumor human colon organoids reveal both individual diversity and basic features of colorectal. Cell Rep. 18, 263–274

18 Ganesh, K. et al. (2019) A rectal cancer organoid platform to study individual responses to chemoradiation. Nat. Med. 25, 1607–1614

19 Wetering, W.J. Van De et al. (2020) SARS-CoV-2 productively infects human gut enterocytes. Science. 369, 50–54

20 Hyun, I. et al. (2020) Ethical issues related to brain organoid research. Brain Res. 1732, 146653