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饱受质疑,但硕果累累!神经所杨辉团队近一年来发表多篇重磅论文

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  近一年来,中国科学院神经研究所杨辉团队连续取得突破,在Cell, Protein & Cell,Molecular Cell,Nature Communications ,Nature Cell Biology,Nature Protocol,Nature Methods 等杂志上发表了7项重要研究成果,在基因编辑领域取得重大进展,iNature系统总结了这些研究成果:
【1】CRISPR-Cas13和CRISPR-Cas12系统中新发现的特征(如“附带效应”或反式切割)已使其能够用于核酸检测。据报道,Cas13a的侧链RNA切割对细胞发育有害。作为CRISPR-Cas12系统的代表性基因编辑器,CRISPR-Cas12a(Cpf1)在未来的治疗应用中具有巨大潜力。然而,当用于哺乳动物细胞中的基因组编辑时,目标激活的Cas12a有在复制,转录和同源性导向的修复过程中裂解瞬时暴露的ssDNA的风险,引起了人们的关注其治疗应用。因此,需要仔细研究由Cas12a的不加区分的ssDNA裂解活性引起的潜在脱靶效应。2021年4月1日,中国科学院神经研究所周昌阳,杨辉及中国农业科学院深圳农业基因组研究所左二伟等共同通讯在Protein & Cell 在线发表题为“Indiscriminate ssDNA cleavage activity of CRISPR-Cas12a induces no detectable off-target effects in mouse embryos”的研究论文,该研究开发了GOAT,无需FACS即可检测基因编辑工具对全基因组的脱靶效应。与GOTI相比,GOAT是一种更简单,成本更低的方法,具有相当的准确性和灵敏度。使用GOAT分析,该研究发现Cas12a(LbCas12a和AsCas12a)的反式ssDNA切割活性在小鼠胚胎中较低,这表明Cas12a在哺乳动物细胞中具有高度特异性。考虑到LbCas12a和AsCas12a具有与spCas9相当的编辑效率,更小的尺寸和更低的错配耐受性,它们在未来的治疗应用中具有广阔的前景和竞争优势。
【2】2021年3月4日,中国科学院神经研究所杨辉,中国科学院上海生化细胞所丁建平及纪念斯隆·凯特琳癌症中心Dinshaw J. Patel通讯共同在Molecular Cell 在线发表题为“Structural basis for self-cleavage prevention by tag:anti-tag pairing complementarity in type VI Cas13 CRISPR systems”的研究论文,该研究确定了Cas13a靶向和区分自身和非自身RNA靶标的能力的分子原理。该研究阐明了调节Cas13a裂解活性的方法,从而影响了Cas13a介导的生物技术应用。
【3】2021年1月4日,中国科学院神经研究所杨辉及周海波共同通讯在Nature Cell Biology 在线发表题为“Endogenous promoter-driven sgRNA for monitoring the expression of low-abundance transcripts and lncRNAs”的研究论文,该研究开发了一种通用的内源性转录门控开关,该开关在存在内源性启动子的情况下释放单向导RNA。 当内源转录门控开关与开发的高度敏感的CRISPR激活物相关报道分子偶联时,可以可靠地检测内源基因的活性,包括表达水平非常低的基因(相对于Gapdh,<0·001;定量PCR分析) 。值得注意的是,该研究还可以使用这种方法监测在活细胞中低水平表达的典型的长非编码RNA的转录活性。总之,该研究方法提供了一个强大的平台,可以感知细胞功能背后的内源性遗传元素的活性。
【4】2020年11月27日,上海科技大学黄行许,池天及中国科学院神经研究所杨辉通讯共同在Nature Communications 在线发表题为“A Cas-embedding strategy for minimizing off-target effects of DNA base editors”的研究论文,该研究发现只需将将编辑酶插入nCas9的中间,就可以显著降低A> G和C> T编辑器的脱靶效应,而不会破坏靶上编辑。 此外,采用这种Cas嵌入策略,该研究创建了一个高度特定的编辑器,能够对甲基化和富含GC的序列进行高效C> T编辑。
【5】2020年8月14日,中国科学院神经研究所杨辉,中国科学院上海营养与健康研究所李亦学及斯坦福大学Lars M. Steinmetz通讯共同在Nature Protocol 在线发表题为“GOTI, a method to identify genome-wide off-target effects of genome editing in mouse embryos”的研究论文,该研究为GOTI提供了详细的技术方案,包括小鼠交配,两细胞胚胎注射,胚胎第14.5天胚胎消化,荧光激活细胞分选,全基因组测序和数据分析。为了增强GOTI的效用,该研究还包括一个称为GOTI-seq(https://github.com/sydaileen/GOTI-seq)的计算流程,用于测序数据分析,可以生成最终的全基因组脱靶变异体直接从原始测序数据中提取。从小鼠交配到测序,该试验方法通常需要20天,而测序数据分析则需要7天。
【6】2020年5月18日,中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心杨辉,究所隶属于的计算生物学研究所(中国科学院-马普学会计算生物学研究所)李亦学及中国农业科学院深圳农业基因组研究所左二伟共同通讯在Nature Methods 在线发表了题为"A rationally engineered cytosine base editor retains high on-target activity while reducing both DNA and RNA off-targeteffects"的研究论文,该研究根据蛋白结构预测了脱氨酶ssDNA结合的重要氨基酸,在不影响催化活性的情况下,突变相应的氨基酸(APOBEC1上的ssDNA结构域相应氨基酸),从而得到了显著降低DNA脱靶的CBE突变体。
【7】2020年4月8日,中国科学院上海神经所杨辉及周海波共同通讯在Cell 在线发表题为“Glia-to-Neuron Conversion by CRISPR-CasRx Alleviates Symptoms of Neurological Disease in Mice”的研究论文,该项研究通过运用最新开发的RNA靶向CRISPR系统CasRx特异性地在视网膜穆勒胶质细胞中敲低Ptbp1基因的表达,首次在成体中实现了视神经节细胞的再生,并且恢复了永久性视力损伤模型小鼠的视力。同时,该研究还证明了这项技术可以非常高效且特异地将纹状体内的星形胶质细胞转分化成多巴胺神经元,并且基本消除了帕金森疾病的症状。该研究将为未来众多神经退行性疾病的治疗提供一个新的途径。

  

  在自然环境中精确地操作遗传信息对于确定基本的生物学设计原则至关重要,并能在各种系统中实现更高水平的调节。先前的研究已经开发了一系列遗传开关,以充当传感器或实现附加的功能。然而,这些策略主要受到处理内源信号的能力有限的阻碍。类似于单向导RNA(sgRNA)可以以高特异性,高效率和多功能性将Cas核酸酶引导至已定义的基因组位点。

  尽管已经开发出多种诱导型sgRNA,以在活细胞中接收内源信号,但这些方法只能显示出对小RNA活性的响应。感测内源基因活性的常规方法通常依赖于将荧光蛋白精确插入蛋白编码区。但是,现有方法无法应用于以低丰度转录的基因。

  越来越多的最新证据表明,长的非编码RNA(lncRNA)在各种生物过程中起着至关重要的作用。但是,lncRNA的功能注释极具挑战性,因为与编码RNA相比,它们不可翻译并且通常以低水平表达。

  在这里,该研究通过直接从内源启动子表达sgRNA来开发通用的内源转录门控开关(Ents)。当Ents与高度敏感的CRISPR-激活子相关的报告子-Suntag-P65-HSF1(SPH)和优化的miniCMV-mCherry(SPH-OminiCMV)结合时,内源基因的表达就如实检测到。值得注意的是,SPH-OminiCMV-Ents具有扩增内源信号的能力,以可视化细胞过程中低丰度转录本和lncRNA的表达动态。

  参考消息:

  https://www.nature.com/articles/s41556-020-00610-9

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