网易首页 > 网易号 > 正文 申请入驻

杨辉强势回应全球科学家质疑:你们没有按我们的实验方法操作!

0
分享至

  2013年8月29日,Whitehead生物医学研究所Rudolf Jaenisch团队(杨辉为第一作者)在Cell 在线发表题为“One-Step Generation of Mice Carrying Reporter and Conditional Alleles by CRISPR/Cas-Mediated Genome Engineering”的研究论文,该研究通过与Cas9 mRNA和不同的指导RNA(sgRNA)以及不同大小的DNA载体共同注入合子,创建了报告基因小鼠和条件突变小鼠。 使用这一一步程序的方法,该研究生成了在Nanog,Sox2和Oct4基因中带有标签或荧光报告基因构建体的小鼠,以及Mecp2条件突变小鼠。此外,使用靶向Mecp2基因中两个不同位点的sgRNA,该研究制备了小鼠,其携带预计约700 bps的缺失。该研究发现通过显微注射2个单指导RNA(sgRNA)和2个单链寡核苷酸作为供体,在产生条件敲除(cKO或floxed)等位基因方面的效率高达16%。

  但是,对于条件敲除的效率达到了16%,在转基因领域引起了震动,众多研究人员质疑杨辉等人的研究成果。2019年8月26日,全球20多个实验室组成联盟,对于杨辉发表在Cell 的研究论文进行了重复,Gurumurthy等人在Genome Biology 在线发表题为“Reproducibility of CRISPR-Cas9 methods for generation of conditional mouse alleles: a multi-center evaluation”的研究论文,该研究从全球20个实验室的联合合作中重新评估了“双供体”的方法。该数据集包含56个遗传基因座,17,887个受精卵和1718个活体出生的小鼠,其中只有15个(0·87%)小鼠包含cKO等位基因。总之,该研究发现“两供体”方法缺乏效率,因为它依赖于同时发生的两个重组事件。使用“单供体”DNA的方法相当有效,因为它们仅依赖于一个重组事件,并且正确插入供体盒而没有意外突变事件。因此,单供体方法为常规生成cKO动物模型提供了更高的效率。

  2021年4月7日,杨辉等人在Genome Biology 发文回复Gurumurthy等人质疑,指出其他已经有团队能重复出来,重复实验时的方法以及试剂浓度都不同,导致了实验无法重复。

  另外,在同一天Gurumurthy等人也发文回应了杨辉在Genome Biology 的回复文章,指出:没有实验室的效率能达到16%,当初的Cell 文章没有公布试剂的使用浓度等细节。最后,Cell 出版社是否会进一步采取行动,我们将持续关注。

  ◎ 杨辉等人在Cell 发表研究成果

  

  CRISPR和Cas(CRISPR相关的)蛋白在细菌和古细菌中起基于RNA的适应性免疫系统的作用。 II型细菌CRISPR / Cas系统已被证明是一种有效的基因靶向技术,可促进多种基因靶向。由于Cas9的结合是由工程单向导RNA(sgRNA)与目标基因组DNA序列之间的简单碱基对互补性指导的,因此可以通过提供工程sgRNA将Cas9定向到任何基因组位点。

  2013年8月29日,Whitehead生物医学研究所Rudolf Jaenisch团队(杨辉为第一作者)在Cell 在线发表题为“One-Step Generation of Mice Carrying Reporter and Conditional Alleles by CRISPR/Cas-Mediated Genome Engineering”的研究论文,该研究通过与Cas9 mRNA和不同的指导RNA(sgRNA)以及不同大小的DNA载体共同注入合子,创建了报告基因小鼠和条件突变小鼠。

  

  Mecp2条件突变小鼠(图源自Cell )

  使用这一一步程序的方法,该研究生成了在Nanog,Sox2和Oct4基因中带有标签或荧光报告基因构建体的小鼠,以及Mecp2条件突变小鼠。此外,使用靶向Mecp2基因中两个不同位点的sgRNA,该研究制备了小鼠,其携带预计约700 bps的缺失。最后,该研究分析了基因修饰小鼠和ESC系中5个sgRNA的潜在脱靶现象,并仅在极少数情况下鉴定了脱靶突变。

  ◎ 全球20个实验室联盟在Genome Biology 发文质疑杨辉等人Cell 的研究成果

  

  CRISPR-Cas9基因编辑技术促进了基因敲除小鼠的产生,为繁琐且耗时的传统基于胚胎干细胞的方法提供了替代方法。杨辉等人的研究发现通过显微注射2个单指导RNA(sgRNA)和2个单链寡核苷酸作为供体,在产生条件敲除(cKO或floxed)等位基因方面的效率高达16%(在本文中称为“双供体融合”方法)。

  2019年8月26日,全球20多个实验室组成联盟,对于杨辉发表在Cell 的研究论文进行了重复,在Genome Biology 在线发表题为“Reproducibility of CRISPR-Cas9 methods for generation of conditional mouse alleles: a multi-center evaluation”的研究论文。

  该研究从全球20个实验室的联合合作中重新评估了“双供体”的方法。该数据集包含56个遗传基因座,17,887个受精卵和1718个活体出生的小鼠,其中只有15个(0·87%)小鼠包含cKO等位基因。该研究对数据集进行了统计分析和机器学习算法,这表明所分析的因素均无法预测该方法的成功。该研究测试了一些在18个基因座上使用单供体DNA的较新方法,其中“两供体”方法未能产生cKO等位基因。该研究发现,“一供体”方法比“二供体”方法效率高10到20倍。

  总之,该研究发现“两供体”方法缺乏效率,因为它依赖于同时发生的两个重组事件。使用“单供体”DNA的方法相当有效,因为它们仅依赖于一个重组事件,并且正确插入供体盒而没有意外突变事件。因此,单供体方法为常规生成cKO动物模型提供了更高的效率。

  ◎ 杨辉等人在Genome Biology 发文回应质疑

  

  Gurumurthy等最近报道了一种由杨辉等人开发的方法,重复性较差。他们声称三个研究中心无法重现我们生成Mecp2基因座的条件等位基因的结果,并且“双供体法”在其他基因座上的成功率很低。

  的确,杨辉等人对这些声明提供了答复:

  1.Yang等人发表的关于Mecp2基因座的结果。分别通过在Jaenisch(正确的等位基因为8–10%),Yang(正确的等位基因为8%)和Hatada组(正确的等位基因为2–6%)中进行了独立实验复制。此外,多家同行评审的出版物已成功使用此方法创建条件基因敲除(CKO)小鼠(成功完成了11个基因座中的9个,效率为2·5%至18%)。杨辉等人注意到,CRISPR / Cas9产生CKO小鼠的效率可能会有所不同,这可能是由于平台功能或实验条件不同所致。

  2. Gurumurthy等人使用的条件不符合本文中使用的条件。Gurumurthy等人的研究使用的CRISPR试剂在Mecp2基因座上的浓度(Cas9 mRNA为10μng/μl,sgRNA为10μng/μl,寡聚体为10μng/μl)的浓度要低得多。众所周知,CRISPR试剂的浓度与基因组编辑效率密切相关。

  3.杨辉等人在原始论文中使用了电压驱动的合子注射方法,该方法允许以更高的浓度注射CRISPR组分。这种方法与Gurumurthy等人使用的原核注射方法之间的区别,也可能会导致成功率的差异。

  通常,在使用任何基因组编辑方法或策略的情况下,不同基因组位点的效率通常变化很大。

  随着基因组编辑技术的快速改进,杨辉和许多其他公司不断优化杨辉等人开发的实验方法。杨辉等人欢迎所有针对特定应用选择最佳策略的讨论,但是,杨辉等人认为,只有通过使用完全相同的实验方法和技术参数,才能验证任何已发表论文的可重复性。

  ◎ Gurumurthy等人在Genome Biology 发文再次回应杨辉的答复

  

  Jaenisch实验室2013年发表在Cell 上的两项研究取得了突破性进展,首次证明了CRISPR介导的基因在小鼠合子中产生敲除和条件等位基因的原理证明,并在转基因小鼠领域中引起了极大的兴奋。但是,在过去的几年中,在许多实验室中,当一步一步产生条件等位基因时,现实却与兴奋不符。

  确实,正如杨辉等人的评论,指出,他们自己对Mecp2基因座(它们的#1点)进行了进一步的重现性实验,这些未发表的结果未能从其原始出版物中再现出16%的效率。而且,我们的研究并不是首次引起人们双供体方法效率的关注,转基因领域其他人的报道也是如此,其中指出:令人失望的是,我们谁都无法复制Jaenisch报告的效率。

  关于他们的第二点,令人遗憾的是,杨辉等人没有报道所用试剂的浓度细节 。现在,作者以此来信称他们在另一份报告中提供了浓度,但是该参考文献没有描述条件等位基因的产生。另外,较大的试剂浓度范围不会影响杨辉等人的方法效率。此外,Hadada的研究小组(Horii等人)尝试复制Mecp2实验,他们报告说,当试剂浓度在较高范围内时,效率非常低或毒性很高。50/12/100的浓度仅产生2%的效率,而100/24/200的浓度导致近90%的胚胎死亡,作者无法确定该较高浓度下该方法的效率。

  关于他们的观点#3,作者推测压电驱动的合子注射可能有助于成功率的差异。有必要通过比较几个基因座并排比较压电驱动和原核注射方法的效率来检查这种推测。由于不同基因组位点的效率通常相差很大,因此收集至少6至10个位点或更多位点的此类并排数据是理想的。否则,该假设仍然是推测性的。

  我们必须以尽可能高的标准来维持已发布的方法,特别是在小鼠转基因领域,在该领域中,广泛采用低效率的基因操作策略可能会对研究中使用的动物数量产生伦理后果总体而言,科学目前存在可再现性危机,作为科学家,我们有责任对公开发表的方法进行严格的测试,并采用更高性能的结果分析有时会自相矛盾,它们本身也会发表。

  参考消息:

  https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(13)01016-7?_returnURL=https%3A%2F%2Flinkinghub.elsevier.com%2Fretrieve%2Fpii%2FS0092867413010167%3Fshowall%3Dtrue#%20

  https://genomebiology.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13059-019-1776-2

  https://genomebiology.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13059-021-02312-3#ref-CR1

  https://genomebiology.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13059-021-02320-3

特别声明:以上内容(如有图片或视频亦包括在内)为自媒体平台“网易号”用户上传并发布,本平台仅提供信息存储服务。

Notice: The content above (including the pictures and videos if any) is uploaded and posted by a user of NetEase Hao, which is a social media platform and only provides information storage services.

相关推荐
热点推荐

“减肥食品”吃出肝损伤,“光明新零售”又被曝出受害者

美商社
2021-05-06 19:06:05

下一个印度出现了?紧急向中俄请求援助,给中国也敲响了警钟

君清奇趣
2021-05-05 17:38:07

美对台出售AGM-88E导弹挑战红线,解放军没有性能相当的武器咋办

刘晓非说
2021-05-06 21:03:11

男朋友乳头的5大妙用,姑娘们不知道真是太亏了!

第十一诊室
2021-05-03 12:18:57

新婚老公酒后猝死,葬礼后公公和我说句话,想通后,我敲开他的门

深夜聊情
2021-05-06 18:49:58

内蒙古猛降20度,恶劣大风将开始!超级计算机:山东辽宁将是重点

中国气象爱好者
2021-05-06 15:57:35

网传让比尔盖茨抛弃发妻的疑似小三中国美女现身:貌似林青霞,学富五车才高八斗!

健身是件美好的事
2021-05-06 09:20:46

70%原料药依赖我国!印度担心无法拿到货:紧盯中国货运航班

金十数据
2021-05-06 11:55:03

妻子偷男人,被丈夫“捉奸在床”却面带嘲笑:“怪你自己没用”

共执桔梗枝
2021-04-24 23:40:53

经过三轮美国制裁,他直言若能扛过去,华为将成为全球最牛企业!

一笑看千秋
2021-05-06 05:58:41

97岁奶奶花30年做500个花球,博物馆争相收藏:美得惊为天人

艺非凡
2021-05-01 13:03:17

海南28岁美女海边晨跑照走红,颜值让人羡慕,大长腿像开了特效

愛旅遊的白果
2021-05-04 14:38:17

历时7年35轮谈判,欧盟为何喊停中欧投资协定?

澳门商报
2021-05-06 09:57:18

陈柏宇爱妻一年内失两胎,13周胎儿患爱德华氏症,宣布此生不再生

树娃
2021-05-06 13:19:51

早该淘汰的12种厨房用具,依然还有人往家里搬,该换就换别舍不得

娱乐使你我开心
2021-05-06 01:09:15

中国引进特斯拉,背后是上海的“阳谋”,已经产生蝴蝶效应

吴贵英娱乐说
2021-05-06 07:10:21

要动真格了?大批导弹瞄准核电站,一旦动手就是核战争

生活蓝天下
2021-05-03 11:17:51

曲协倡议书引声讨,南开教授:与低俗相声相比,我更讨厌歌功颂德

品悦生活
2021-05-06 12:18:29

保利尼奥转会细节遭曝光:欲提前解约!最快几周内离开恒大

少女盗梦贼
2021-05-06 15:51:07

殷桃“真人”长什么样?当看清近距离生图后,40岁真实样子太绝了

小司谈热点
2021-05-06 09:04:04
2021-05-07 04:25:07
iNature前沿
iNature前沿
专注科学动态、传递科普信息
1554文章数 46880关注度
往期回顾 全部

科技要闻

河南女车主起诉特斯拉陶琳 索赔5万元

头条要闻

美国改口支持放弃新冠疫苗专利 打的什么算盘?

头条要闻

美国改口支持放弃新冠疫苗专利 打的什么算盘?

体育要闻

这也没进?曼奇尼门前两米失良机,被德赫亚快速反应挡出

娱乐要闻

夏日女友!秦岚穿背心热裤秀身材

财经要闻

汽车要闻

基本确定配激光大灯 新宝马X3官图泄露

态度原创

家居
时尚
教育
数码
军事航空

家居要闻

港男月入过万只能带妻儿住7平蜗居 在洗衣机上做饭

在韩出道3年的流量女星,回国会更好吗?

教育要闻

涉嫌非法办学 重庆11家校外培训机构被列入“黑名单”

数码要闻

女装大佬晒性感私房照被围观:感受颜值暴击!

军事要闻

一图了解世界强国步兵班组武器配置