全舒团队开发一种新型蛋白质体内稳定性检测探针

责编 | 酶美

蛋白质作为生命活动主要的承载者，维持特定的三维结构是其发挥生物学功能的基础。但蛋白质发挥功能又必然伴随着动态变化，因此需要具备一定的结构灵活性。这一悖论使得蛋白质在漫长的进化过程中仅保持了边缘稳定性(marginal stability) 【1】。蛋白质的这一性质使其在生物体内的折叠过程容易受到影响，例如当细胞遭遇胁迫环境（如高温、重金属、活性氧等）时，蛋白质会因变性而失去活性，甚至因错误折叠而聚集沉淀。另一方面，蛋白质的体外应用也受到其稳定性的限制，如药用蛋白的稳定性决定其制备保存及体内半衰期、生物催化剂的稳定性影响其对严苛反应环境的耐受性等。在结构生物学等基础性研究中，蛋白质的稳定性及可溶性程度越高，得到其晶体并解析其结构的可能性也越大【2】。

尽管提升蛋白质的稳定性具有深刻的理论研究意义和广泛的实用价值，但用于提高蛋白质稳定性的工具仍然非常有限。目前增强蛋白质稳定性主要采用理性设计、定向进化或两者相结合的手段。与理性设计的方法相比，定向进化技术不受蛋白质结构、功能信息的限制，且具有无可比拟的高通量。利用定向进化技术进行蛋白质稳定性改造的瓶颈在于建立有效评估蛋白质折叠状态的高通量筛选/筛查策略【3】。目前已有的稳定性检测系统存在分辨率不足、假阳性率过高、操作流程复杂等缺陷，使突变体分离效率受到限制。

3月23日，华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室的全舒教授课题组在PNAS杂志发表了题为 An enzyme-based biosensor for monitoring and engineering protein stability in vivo 的文章，报道了一种能够针对多种底物蛋白、操作便捷、基于荧光表型的蛋白质稳定性进化筛选工具。作者通过对大肠杆菌来源的尿卟啉原III甲基转移酶CysGA的改造与优化，得到了具有高分辨率、高灵敏度的新型蛋白质体内稳定性检测探针，并展示了其在提升目标蛋白稳定性、防止淀粉样蛋白聚集、获得目标蛋白单残基分辨率下的全局稳定性景观图方面的应用。

CysGA能够催化细胞内源底物生成具有红色荧光的产物（可直接在紫外灯下观测），已被用于表征基因转录【4】。为将其改造为稳定性报告蛋白，作者首先对CysGA可拆分位点进行了筛查，成功构建了将目标蛋白插入CysGA中的“三明治”型探针：若目标蛋白折叠良好，CysGA被拆分的两部分能够足够接近从而重构成具有活性的构象，催化荧光产物的积累使细胞具有红色荧光；反之，若目标蛋白不稳定、易聚集或易被细胞内蛋白酶降解，则会影响CysGA的活力重构，使得细胞无法产生红色荧光信号。作者测试了不同种类、不同大小、不同来源的蛋白，发现测试蛋白体外表征的热力学稳定性与细胞表现出的荧光信号具有良好的线性关系，并且荧光表型与融合蛋白的可溶表达水平也具有良好的线性关系。由此作者建立了目标蛋白的稳定性与可筛选表型间的良好关联。

作者随后将构建的“三明治”CysGA探针应用于蛋白质的稳定性定向进化，成功筛选、鉴定出了稳定性提升的人源酰基磷酸酶（AcP）突变体和聚集倾向减弱的人胰岛淀粉样多肽 (hIAPP) 突变体。

最后，作者将该探针与深度突变扫描技术结合，系统地分析了组蛋白H3K4甲基转移酶催化结构域MLL3SET位点特异的突变耐受性和稳定性，绘制了单个氨基酸残基分辨率下的稳定性全局景观图，在鉴定出影响MLL3SET稳定性的关键氨基酸残基及其潜在稳定化改造热点区域的同时，也获得了MLL3SET稳定性提升的若干突变体，为后续阐释这一在表观遗传过程中发挥重要功能的蛋白的结构灵活性与催化活性的关系打下了良好基础。

相比较其他蛋白质稳定性检测探针，CysGA探针的构造方式能够有效避免直接与目标蛋白首尾相连造成的假阳性率高的缺点；基于酶催化的放大效应，灵敏度更高；在其荧光产物检测波长范围（Ex=357nm，Em=620nm）受细胞内源荧光信号干扰较小，有效提升了分辨率。由于CysGA的底物-尿卟啉原Ⅲ在生物中普遍存在，因此该探针系统也具备在高等生物中进行检测的潜力，并应用来检测更复杂的蛋白质行为，例如筛选稳定蛋白质复合物等。值得注意的是，相较于GFP等荧光蛋白的生色团成熟依赖于有氧条件，CysGA探针的荧光信号积累不依赖于氧气，从而具备在特殊的厌氧、乏氧环境中发挥功能的潜力，能够有效弥补以GFP为报告蛋白的稳定性检测探针的不足。

综上所述，该工作为蛋白质稳定性的研究提供了新的工具，不仅能够应用于蛋白质相关的基础研究以及生物催化剂、药用蛋白质的稳定性提升，还在蛋白质折叠相关疾病的药物开发上具有广泛的前景。此外，描绘单个残基水平的蛋白质稳定性景观图，能系统地分析蛋白序列与稳定性的关系，为蛋白质的理性改造以及蛋白质的人工设计提供实验数据集的支撑。

华东理工大学生物工程学院的博士生任畅为本论文的第一作者，华东理工大学为论文唯一署名单位，全舒教授为论文的通讯作者。华东理工大学硕士生温欣、孟子钧为本论文做出了重要贡献。

原文链接：

https://www.pnas.org/content/118/13/e2101618118

参考文献

[1] D.M. Taverna, R.A. Goldstein, Why are proteins marginally stable?, Proteins 46 (2002) 105-109.

[2] M.C. Deller, L. Kong, B. Rupp, Protein stability: a crystallographer's perspective,Acta Crystallogr F Struct Biol Commun 72 (2016) 72-95.

[3] C. Ren, X. Wen, J. Mencius, S. Quan, Selection and screening strategies in directed evolution to improve protein stability, Bioresour Bioprocess 6 (2019) 53.

[4] C.A. Roessner, Use of cobA and cysGA as red fluorescent indicators, Methods Mol Biol 183 (2002) 19-30.