张锋团队发现CRISPR相关转座系统归巢的两种机制

　　撰文 | 木兰之枻

　　责编 | 兮

　　原核生物中，CRISPR-Cas系统的功能并不局限于适应性免疫，它还能参与转座子的转座调控。近来的研究指出，CRISPR相关的转座系统（CAST）参与调控RNA介导的Tn7-like转座子的定向转座。在此基础上，研究者对V-K型和I-F型两类不同的CAST系统进行改造，并成功实现了大片段DNA在细菌基因组中的定向整合（详见BioArt报道：专家点评Science+Nature长文| 当CRISPR遇上转座子——实现位点特异性DNA片段的高效、特异插入）【1,2】，这提示我们CAST系统能为基因编辑工具的开发带来新的启发，值得深入研究。研究者注意到，大多数CAST系统在原核生物基因组中的转座过程并不受CRISPR阵列中的crRNA调控，其转座整合位点多位于细菌染色体中特定保守位点的附近（这一现象被称为转座子归巢，其对应的位点称为归巢位点）。目前CAST系统归巢的具体机制仍缺少研究，这也限制了研究者对CAST系统的进一步改造和应用。

　　2021年3月25日，来自美国Broad研究所的张锋实验室在Cell发表题为Dual modes of CRISPR-associated transposon homing的论文。文章对不同类型CAST系统的归巢机制进行了系统研究，结果发现了两种截然不同的归巢机制：其中V-K型CAST系统依赖于CRISPR阵列之外的异位短链crRNA实现归巢，而I-B型CAST系统则依赖于TnsD蛋白实现归巢。这一研究让我们对CAST系统的多样性有了更深入的认识，也为未来的改造和应用奠定了基础。

　　研究者首先对多种V-K型CAST系统在细菌基因组中的整合位点进行生物信息学分析，结果发现多数V-K型CAST系统均位于tRNA基因附近。随后研究者选取shCAST开展功能研究，结果发现shCAST在tRNA基因附近的整合依赖于Cas12k蛋白。随后的序列分析发现，shCAST左侧末端（LE）序列中包含一种独特的异位短链crRNA，该crRNA位于CRISPR阵列之外，但与阵列中的crRNA有相似的结构，如5’端的直接重复序列（DR）和3’端靶向归巢位点的靶序列。研究还指出，类似的异位crRNA在V-K型CAST系统中普遍存在，且绝大多数能与V-K型CAST系统的归巢位点相呼应。总体而言，V-K型CAST系统的归巢过程依赖于Cas蛋白和异位crRNAs介导的定向整合，这一机制与之前I-F型CAST系统的转座机制有相似之处（详见BioArt报道：Cell | Tn7-CRISPR-Cas转座系统向导RNA的功能特化 ）【3】。

　　然而I-B型CAST系统中并不存在类似的异位crRNAs体系，这提示我们不同类型的CAST系统有着不同的归巢机制。研究者对I-B型CAST系统进行分析后发现，I-B1型CAST系统能编码两种TniQ蛋白，而V-K型及I-F型则只编码一种。与其它CAST系统中的TniQ相比，I-B1型的两种TniQ蛋白与Tn7转座系统中的TnsD蛋白相似程度更高，这其中序列更长的TniQ有着最高的相似度，后续研究中也被命名为TnsD以区分两种不同的TniQ。随后研究者选取AvCAST系统开展功能实验。结果发现， AvCAST系统可在crRNA的引导下实现定向转座，其中tniQ是该转座过程的关键因子，而tnsD则抑制crRNA介导的定向转座。研究者还指出，与I-F及V-K型CAST系统相似，借助于靶向不同位点的crRNAs，AvCAST系统也能介导大片段DNA在细菌基因组不同位点的定向整合。

　　虽然tnsD蛋白无益于RNA介导的AvCAST转座过程，但它能直接识别基因组中特定的保守位点，从而介导I-B1型CASTs的归巢。功能研究指出，AvCAST系统的归巢过程是由tnsD介导，而tniQ与Cas相关蛋白并不参与其中。研究者还发现，同属I-B型的I-B2型CAST系统具有类似的归巢机制，即tnsD蛋白直接介导CAST系统在基因组特定保守位点附近的整合。

　　图1 CRISPR相关转座系统（CAST）的归巢机制示意图。

　　总体而言，本研究发现了两种不同的转座子归巢机制：V-K型CAST系统依赖于异位短链RNA介导的定向整合，而I-B型CAST系统则依赖于蛋白质介导的定向整合（图1）。此外，本研究还发现，I-B型CAST系统能在RNA的引导下实现位点特异性整合，表明这类CAST系统有望成为基因编辑工具研发的新基石。综上可知，本研究拓展了我们对CAST系统转作机制的认识，对未来基因编辑工具的开发有重要的促进作用。

　　转载须知

　　【原创文章】BioArt原创文章，欢迎个人转发分享，未经允许禁止转载，所刊登的所有作品的著作权均为BioArt所拥有。BioArt保留所有法定权利，违者必究。

　　原文链接

　　https://doi.org/10.1016/j.cell.2021.03.006

　　参考文献

　　1. Klompe, S. E., Vo, P. L. H., Halpin-Healy, T. S. & Sternberg, S. H. Transposon-encoded CRISPR–Cas systems direct RNA-guided DNA integration. Nature 571, 219–225 (2019)
2. Strecker, J. et al. RNA-guided DNA insertion with CRISPR-associated transposases. Science 365, 48–53 (2019)

　　3. Petassi, M.T., Hsieh, S.-C., and Peters, J.E. Guide RNA categorization enables target site choice in Tn7-CRISPR-Cas transposons. Cell 183,1757–1771 (2020)