蒋华良：冷冻电镜结构测定发现G蛋白偶联受体信号传导新化学修饰

　　编者按：2021年1月12日，中科院上海药物研究所蒋华良院士在Science China Life Sciences发表文章Cryo-EM structure determination captures new chemical modification of protein，对1月6日发表在Nature上的一篇文章进行了点评（详见BioArt报道：Nature | 孙金鹏/张岩/徐华强合作揭示黏附类受体GPR97感知糖皮质激素并激活Go的结构基础），同时还对冷冻电镜在揭示蛋白质修饰方面进行了展望。

　　撰文 | 蒋华良 院士（中国科学院上海药物研究所）

　　责编 | Qi

　　以生物学“中心法则”的建立为标志，人类基本掌握了生物物种遗传和进化的分子机制。然而，进入二十一世纪以来，随着人类基因组计划的完成，人们很快发现，虽然生命个体的演化主要取决于遗传基因的序列，但其复杂性和多样性无法仅由“中心法则”解释。包括蛋白质、核酸和多糖在内的生物大分子是生命活动的基本“元件”，为生命过程提供了物质基础，其自身则处于动态的化学修饰和调控当中。这些生物大分子的动态化学修饰在生物个体的发育和细胞命运的调控中均扮演了关键角色，并对疾病的发生和发展起着决定性的作用。生物大分子的动态修饰已成为当前生命科学最受关注的前沿领域之一，也是化学与生命科学和医学交叉界面上最为活跃的研究前沿。因此，2017年国家自然科学基金委启动了“生物大分子动态修饰与化学干预”重大研究计划，发现新的生物大分子的化学修饰，进而研究新修饰的生物学功能，是本重大研究计划的一项重要任务。作为该重大研究计划专家组组长，我一直关注国内有关方面的研究。

　　2021年1月6日，来自山东大学的孙金鹏团队、浙江大学的张岩团队和上海药物研究所的徐华强团队在Nature杂志上合作发表了一篇题为Structures of the glucocorticoid-bound adhesion receptor GPR97–Go complex的文章（Nature | 孙金鹏/张岩/徐华强合作揭示黏附类受体GPR97感知糖皮质激素并激活Go的结构基础），这项研究解析了黏附类G-蛋白偶联受体 (GPCR)GPR97在糖皮质激素激活状态下与G蛋白复合物的三维结构，并揭示了内源性配体糖皮质激素氢化可的松和抗炎药物倍氯米松的作用机制。

　　该研究引起我兴趣的不是GPCR-G蛋白及其内外源性配体复合物的电镜结构，而是电镜结构测定结合蛋白质质谱 (MS)分析发现的GPCR与G-蛋白结合时G-蛋白上棕榈酰化修饰，据我所知，这是在G-蛋白α-亚基C末端上首次发现的新修饰，预示着结构生物学技术可能可以介入生物大分子化学修饰研究，为表观遗传学等领域的研究提供新的技术和策略。

　　孙金鹏、张岩和徐华强等利用单颗粒冷冻电镜技术获得了GPR97-Go-氢化可的松以及GPR97-Go-倍氯米松两个三元复合物的三维结构，分别率分别为2.9 Å和3.1Å。在解析结构过程中，他们发现Go蛋白C末端有多余的电镜密度，长度约17 Å，看上去似乎像长链脂肪酸。于是他们请国家蛋白质中心的杨靖研究员课题组进行质谱鉴定，发现Go蛋白C末端C351侧链有棕榈酸化修饰，再反过去拟合电镜密度，发现棕榈酸的羧基与C351的巯基形成共价键，脂肪链插入在TM3和TM5之间（见图1）。

　　图1. Go的C351棕榈酰化修饰及其与GPR97的相互作用，灰色网显示棕榈酰化修饰的电镜密度

　　上述研究并非第一次用结构生物学方法观察到蛋白质翻译后修饰。在2015至2017年间，也是徐华强课题组利用自由电子激光X射线技术解析了视紫红质素受体(Rhodopsin) 与下游信号传导蛋白Arrestin复合物的晶体结构【1,2】，这也是第一个GPCR-Arrestin复合物三维结构。这些结构解析首次在GPCR三维结构水平观察到蛋白质的化学修饰，他们的结构清楚地展示了视紫红质素受体C末端磷酸化修饰的模式，并通过功能验证，首次获得了GPCR磷酸化密码（见图2），为理解整个GPCR信号特异性传导提供了分子与结构基础。这两项工作影响较大，然而GPCR的C末端磷酸化修蚀早就有人报道，徐华强等第一次在三维结构上看到了具体结构信息。这一次的工作又有新的进展，用结构生物学技术发现了蛋白质的新化学修饰，并获得了三维结构信息。

　　图2.视紫红质素受体-Arrestin复合物三维结构图，其中园圈标注视紫红质素受体的C末端T336和S338磷酸化位点

　　用传统的X-衍射晶体学方法很难测定修饰后蛋白质等生物大分子的三维结构，我个人认为X-衍射晶体学对表达蛋白质的纯度和结晶的要求较高，为了得到高纯度且高质量的晶体，蛋白质等生物大分子固有的化学修饰被破坏，有些化学修饰后的蛋白质（如糖基化蛋白质）不容易获得高质量的晶体，核磁共振（NMR）测定生物大分子的结构又比较困难。这些可能是以往的结构生物学方法和技术很难观察到蛋白质等生物大分子的修饰的原因。

　　徐华强等用自由电子激光X-射线技术测定的紫红质素受体-Arrestin复合物的三维结构中看到磷酸化修饰，可能也是因为自由电子激光技术测定结构时对蛋白质的晶体要求不高。冷冻电镜技术的发展，最后能测定较高分辨率和分子量较小生物大分子的三维结构，特别是能用于蛋白质、DNA或RNA、小分子等复合物的三维结构的测定，由于不需要结晶过程，如样品处理得当，蛋白质等生物大分子的内源性化学修饰在单颗粒形成中得以保留，冷冻电镜测定的高分辨率三维结构，可以观察到某些化学修饰的位点和电镜密度，再有的放矢地进行质谱测定，可以较为准确地发现发生了何种修饰以及在三维结构水平上推出这种化学修饰的调控作用，为功能研究提供重要线索。

　　https://www.nature.com/articles/s41586-020-03083-w

　　https://engine.scichina.com/publisher/scp/journal/SCLS/doi/10.1007/s11427-021-1886-8?slug=abstract

　　制版人：Kira

　　参考文献

　　1. Y Kang, XE Zhou, X Gao, Y He, W Liu, A Ishchenko, A Barty, TA White, …, H. Eric Xu (2015) Crystal structure of rhodopsin bound to arrestin by femtosecond X-ray laser.Nature523 (7562), 561-567

　　2. XE Zhou, Y He, PW de Waal, X Gao, Y Kang, N Van Eps, Y Yin, K Pal, .. …, H. Eric Xu (2017). Identification of phosphorylation codes for arrestin recruitment by G protein-coupled receptors.Cell170 (3), 457-469. e13