【收藏】从pKa到流动相pH的科学选择

一、基本概念和pKa的确定或预测

基本概念

pKa：酸式解离常数Ka的负对数，即 ：

对于酸HA，它在水（或者其他溶剂）中会发生一定程度的解离（也可以理解为酸碱反应）：

它的解离常数：

由于Ka的值可以非常小（10-50）或者非常大（1012），范围跨度很大，因此使用起来不方便。为了方便起见，定义了pKa来表示酸的酸性强度：

pKa越小，酸性越强；反之，酸性越弱。pKa的大小和化合物本身的结构有关，也和溶剂有关，比如在水中测到的pKa和在DMSO中测到的就不一样（后面还会详细介绍到当配置流动相时，有机溶剂加入缓冲液后引起pKa和pH的变化）。

相应的，碱性化合物的电离常数为Kb，也有用Kb的负对数pKb表示碱性强度。由于Kb与它的共轭酸的电离常数Ka的乘积为常数，因此一般用它们的共轭酸的pKa表示其酸碱性，其共轭酸的pKa越大，碱性越强，反之碱性越弱。

pH: 氢离子浓度指数，即：

大部分的用反相色谱分析的化合物都具有一些可离子化的官能团，比如羧基（-COOH）、磺酸基（-SO3H）或者氨基（-NH2）。而在反相色谱中，样品的保留情况和其官能团的离子化状态关系密切，中性态和离子态之间的保留时间往往可以有高达30倍的差异。因此如果想要获得好的色谱选择性和保留重复性，对离子化程度的各种影响因素的理解就很重要。

可离子化的分析物的反相保留取决于它们的离子化程度，一般离子化程度越高，在反相固定相（如C18）上的保留越弱，在中性状态时保留最强。而分析物的离子化程度取决于流动相的pH值和分析物的pKa值，因此保留时间也就取决于流动相的pH和分析物的pKa。

对于酸性和碱性分析物，其保留因子和流动相pH的关系图为：

即酸性条件（低pH值）有利于酸性分析物的保留，而碱性条件有利于碱性分析物的保留。且在pH大于或者小于某个值时，保留因子不随pH的变化而变化，而在这两个阶段中间，保留取决于离子化程度：

这里k表示分析物的保留因子，k0是分析物的质子化（即分子态）时的保留因子；k1是分析物去质子化（即离子态）时的保留因子；d是去质子化的程度：

这个方程里的pH是指流动相的实际的pH，pKa是化合物在这种流动相条件下的pKa。

对于同时带有酸碱基团的化合物来说，两性离子状态（即既带有正电荷，又带有负电荷）的保留比只带有一种电荷时保留要弱，因为其离子化程度更高。比如说对于一些氨基酸，在等电点时保留最弱。这种化合物的保留因子和流动相pH的关系图如下：

因此可以说，分析物的pKa决定了化合物的保留情况变化的pH范围。如果pH值在化合物的pKa的±2个单位之外，分析物会99%呈现电离态或者未电离态。这意味着这个区间之外保留时间不随pH的变化而变化；然而在这个区间之内，特别是pKa的±1.5个单位之间，保留时间随着pH的变化非常明显，这意味着要获得重复性好的保留时间，在实际操作中对pH进行严格的控制非常有必要。

pKa的确定或预测

既然pKa那么重要，我们怎么才能获得分析物的pKa值呢？

第一，对于已知化合物，我们可以通过一些数据库进行查询。在这里比较推荐两个开放的数据库，一个是英国RSC的www.chemspider.com，这是一个通用型的数据库，收录的化合物类型也比较广；另一个是针对于药物分子数据的加拿大数据库www.drugbank.ca，只要输入目标化合物的CAS号或者英文名，就很可能可以在这两个数据库上查到相关信息。

第二，假如我们没办法在数据库中查到相关信息，我们可以根据一些已知数据进行预测。对于一些典型的化学物，我们应该熟知它们的pKa。最常见的脂肪族羧酸pKa值约为5，比如布洛芬的pKa为5.2；典型的胺类化合物的pKa约为9，比如阿米替林的pKa是9.4。这样在分析一些酸碱性的问题时就可以信手拈来，方便快捷。如果要尽量准确地预测一个新化合物的pKa，这就是一个比较系统的工程，因为一般一个化合物的pKa除了与它的关键基团如羧基、氨基等有关，还和这些基团所连接的其他结构有关，因此最好以结构尽量类似的已知化合物的pKa为基础进行预测。下面摘取了《Modern Physical Organic Chemistry》中常见结构的酸碱化合物在水溶液中的pKa:

二、缓冲液

基本概念

缓冲液（Buffer）：指由一种共轭的质子给体和质子受体构成的可离子化合物的溶液，它可以在加入少量酸或碱时维持溶液pH稳定的作用。常用缓冲液溶质的pKa数据如下：

缓冲液的作用主要有两个方面：

（1）缓冲分析物，使其保持在所需的pH值处。由于在实际分析工作中，色谱柱上的样品质量非常少，因此仅需要很少的缓冲液就能为样品提供足够的缓冲。如果样品与流动相的pH值相差大，且进样量太大，建议在进样前先调节样品溶液至接近流动相pH值。

（2）缓冲色谱柱，使其保持恒定的pH值。由于大量的缓冲流动相通过色谱柱，所以固定相不断暴露在缓冲液中。随着现在商品化的硅胶基质色谱柱纯度的提高，硅胶上的酸性硅醇基团的含量也越来越低，因此所需的缓冲液也越来越少。下图是高纯、中等纯和低纯硅胶的柱子在添加0.1%和增加0.01%TFA时分析图谱对比：

缓冲能力（Buffer Capacity）：它取决于两个因素：

（1）缓冲液的浓度。下图就是醋酸盐在5 MM，10 mM，20 mM和40 mM浓度下的缓冲容量，可以看到它往往在它的pKa，即pH 4.75处呈现最大的缓冲能力，而且随着浓度增加，缓冲能力也增加。

因此为了获得足够的缓冲能力，一般需要适当浓度的缓冲液。推荐的最终溶液中，对于酸性添加剂一般在0.1% v/v左右，或者至少含有5-10 mM的缓冲液。一般来说，对于大多数的应用，10-25 mM的添加剂已经足够，但是最好根据具体情况确定。

（2）溶液的pH和缓冲盐pKa的差值。不同的缓冲液一般有不同的缓冲范围，一般来说，在其pKa值上下浮动1个pH单位内使用时，缓冲液是最有效的；在pKa值上下浮动2个单位内时，也可以提供足够的缓冲。因此从上表中就可以得到缓冲液对应的缓冲范围。

有机溶剂存在下的pKa和pH的变化

文献中缓冲盐的pH和pKa以及分析物的pKa数据很多是在水中测定，但是pH和pKa都会随着有机溶剂的加入而发生改变。一般来说随着有机溶剂的加入，酸的pKa变大，而碱的pKa变小。虽然有这些变化，缓冲液的缓冲能力并不会因为有机溶剂的加入而发生变化。因此在配置缓冲液的时候，强烈建议在加入有机溶剂之前调节pH值至目标值，当加入有溶剂后，溶液pH会发生变化，但是此时无需再调节。另外，为防止混合过程中缓冲盐发生析出，务必将有机相加入水相，而不是将水相加入有机相。

常用缓冲盐点评

磷酸盐：是HPLC在紫外检测条件下最常用的缓冲液之一，因为它可以在低于220 nm的波长下使用。磷酸盐具有三个pKa值，可提供pH 1.1-3.1，6.2-8.2，11.3-13.3三个缓冲范围，。虽然它使用广泛，但是也要注意它的溶解度问题，防止高浓度条件下在HPLC泵或者色谱柱中析出。

醋酸盐：也是HPLC在紫外检测条件下最常用的缓冲液之一，可以在低于220 nm的波长下使用。它可以提供pH 3.8-5.8的缓冲范围，因此它刚好填补了磷酸盐在pH 2.0-8.0之间的缺口。

因此磷酸盐和醋酸盐的配合使用可以满足通常用于硅胶基质色谱柱的整个pH范围。

三氟乙酸：0.1%的三氟乙酸能产生pH≈2的流动相，多年来它一直是低pH条件下LC-MS的首选添加剂，但是TFA能够抑制电离，导致信号下降。TFA也可作为离子对试剂，广泛用于蛋白和多肽类的分析。

甲酸：0.1%的甲酸能产生pH≈2.7的流动相，已经成为低pH条件下LC-MS的首选。

三、确定合适的流动相pH

流动相的pH是改变HPLC选择性的最有效的变量之一。在很多情况下，流动相的pH的改变会造成分析物的保留因子k的改变，另外也会对色谱峰展宽和拖尾产生重要影响。一般来说，pH的改变主要通过三个方面影响反相分离行为：溶剂化情况变化、固定相的改变或分析物的离子化状态改变。在这里，我们主要聚焦于流动相pH如何影响分析物离子化状态进而改变其疏水保留行为。

分析物疏水性的随着pH的变化情况与分析物分子上的可离子化基团的类型和数量有关，因此相对比较复杂，不能像优化其他因素（如有机相浓度、柱温）一样可以通过软件来优化。因此，当我们优化方法中pH的时候考虑化合物结构是非常明智的，这可以缩小pH的考察范围，让实验更精准高效。

前面提到有机相的加入会影响流动相的pH以及分析物的pKa，因此如果没考虑到这些因素会导致使用“±2规则”时出现老司机翻车的情况。举个例子：

阿米替林（Amitriptyline）在水中的pKa是9.4，缓冲液磷酸盐水溶液pH被调节到7.0，我们可以看到两者的差值为2.4个pH单位，因此可以预料到当把阿米替林溶解到这种缓冲环境中会完全被质子化而呈现离子态。但发现以磷酸盐水溶液(pH 7.0)/甲醇 = 35/65为流动相时，通过测试阿米替林的保留时间发现只有1/3的阿米替林被质子化，也就是说甲醇的加入让流动相pH和阿米替林的pKa都发生了漂移，而使阿米替林在这种情况下只有部分被质子化。

在这里，我们需要根据加入的有机相的类型和比例对pH的选择进行校正。对于乙腈，比例每改变10%，pH的校正因子为0.2个单位；对于甲醇，比例每改变10%，pH校正因子为0.1个单位。0-60%的范围内，校正因子还是比较准确的。

对于有机溶剂存在下流动相pH的校正只有简单的两步：1.分别计算有机溶剂加入对缓冲液pH和对可离子化分析物pKa的影响；2.对两者的影响进行加和。

存在有两种情况：

1. 假如缓冲液和分析物都是酸性或碱性，有机相的加入对pH和pKa的影响会很大程度抵消掉，总的校正因子约为0；此时，可以直接根据分析物的pKa来确定配置的缓冲液的pH。

2. 假如缓冲液和分析物的酸碱性不一致，即一个是酸性另一个是碱性，加入有机相时影响会非常大。有机相比例在0-60%的范围内，总的校正因子为对于乙腈，比例每改变10%，校正因子为0.4个单位，即对于酸性分析物pH校正因子为+0.4个单位，对于碱为-0.4个单位；对于甲醇，比例每改变10%，校正因子为0.2个单位，即对于酸性分析物pH校正因子为+0.2个单位，对于碱为-0.2个单位。

下图为有机相为乙腈时（甲醇的情况可以相应地计算出来），当分析物和缓冲液酸碱性不一致时的校正因子数据：

举个例子，假如选用的流动相中缓冲液为酸性，而分析的化合物为碱性时，如果从这种碱性化合物的pKa预测到pH 3-5是应该避免的区间，当我们的流动相条件中含有50%的乙腈时，校正因子为-2，因此可以预测到应该避免的区间为pH 1-3，这样可以获得稳定的保留时间。

缓冲液pH选择的系统方法

当分析一个给定的样品时，即使存在一个或者更多的化合物是未知的，选择合适pH的缓冲液是一个相对简单的过程。一般来说如果其中一个化合物什么官能团都不知道，它一般存在的量是很少的，因此峰形不是大问题。另外，未知化合物往往倾向于拥有和样品中其他化合物类似的官能团，因此用已知化合物的pKa值作为参考的起点是很合理的。

一个系统的选择缓冲液pH方法是：

1.收集样品中化合物的所有结构信息；

2.获得或者预测所有化合物的pKa值；如果只有部分结构已知，则考虑那些可离子化的官能团；

3.根据“让每一种化合物保持为非离子化状态”这一原则在把pH划分为“可用/不可用”区间，这就要参考“±2规则”。当有冲突出现，优先考虑主要成分然后把可用的区域移动到其他化合物能够充分离子化的pH范围；

4.在预测的pH条件下进行一个缓慢的梯度实验，评估分析物洗脱出来的溶剂强度并根据需要相应地调整pH；

5.配制新的缓冲液，再次进样；

6.如果有需要，可以在小范围内优化pH，以及/或优化其他参数。如果方法适用性对pH非常敏感，我们应该考虑把pH微调至一个更合理的pH范围；如果这不能实现，可能就需要非常小心地控制其他因素，包括柱参数和温度；

7.当确定最终方法时，最好基于缓冲盐的质量而不是用pH计和用酸碱滴定来调节pH的方法来配置缓冲液，因为pH计的维护常常被忽略而导致测定值的不准确。

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