Cell | 将乙酰胆碱传感器改造成血清素传感器

撰文 | 小黑

责编 | 兮

血清素，又称5-羟色胺，是一种单胺型神经递质，能够影响人的认知行为。血清素分泌失调可以造成精神疾病，比如抑郁，焦虑等等【1】。针对这些病症的药物研发需要深刻理解血清素通路，也就是说，我们需要一个高分辨率传感器能在时间和空间上精确测量血清素的释放，流动过程。传统的血清素测量方法有微透析, 快扫描循环伏安法和放射性同位素示踪技术，但是它们或多或少在空间或者时间上无法取得较高的分辨率。最近10年随着荧光蛋白标记技术的发展，科学家可以直接对神经递质和神经调节剂进行精确成像，从而能够研究它们对动物行为的影响【2】。

荧光蛋白标记技术需要将目标蛋白与带有荧光蛋白修饰的G蛋白偶联受体或者微生物周质结合蛋白 (periplasmic binding proteins，简称PBPs) 进行结合，从而能在显微镜下进行成像。然而基于G蛋白偶联受体的传感器过于敏感，并且很难在细胞内部进行标记，因此不适用研究血清素的输运过程。所以这里主要采用的是基于PBPs的传感器【3】。PBPs具有可溶性，可作用于细胞内部，但是其具有一些缺陷，比如跟药物作用的蛋白的靶点不多，由于来源于微生物，不太参与细胞中的信号通路，此外PBPs与小分子结合时会使构象剧烈变化，从而导致荧光信号动态范围过宽。

通常大家通过设计结合位点去改进PBPs传感器解决上述困难。比较常用的是点饱和突变技术对PBPs的基因进行改造，获取突变的蛋白，然后针对荧光强度，动态范围，动力学和亲和力这一系列指标进行优化筛选【4】。点饱和突变技术产生的突变蛋白适用于目标蛋白结构相近的情况，比如把与乙酰胆碱结合的PBPs改造成能与尼古丁结合的PBPs【5】，但是因为血清素和乙酰胆碱结构差异较大，没有办法将与它改造成能与血清素结合的PBPs。

随着计算机技术的发展，计算生物学可以成功预测能与特定小分子进行选择性结合的蛋白质结构并对蛋白质功能进行优化。2020年12月16日，来自加利福尼亚大学戴维斯分校的Lin Tian和Loren L. Looger研究组在Cell上发表题为Directed Evolution of a Selective and Sensitive Serotonin Sensor via Machine Learning的文章，作者首次将计算生物学应用到改进传感器的设计，并结合饱和突变技术产生的实验数据进行机器学习分析，预测最优的突变体的结合点，反复迭代设计，最终发现对19个点位进行突变，能成功将乙酰胆碱传感器改造成血清素传感器。新的传感器（iSeroSnFR）对血清素的结合力提升了5000倍，同时不与原来敏感的胆碱和乙酰胆碱进行结合。

合成iSeroSnFR的流水线如下：

第一步，作者选择一个来自于嗜热嗜热厌氧菌X513的对胆碱结合的PBPs的变体iAChSnFR作为起始模板。选择该模板的原因是因为其与血清素有可观测的反应。作者再使用Rosetta套装软件【6】对预测该模板的变体与血清素的结合能力，并在250000种预测变体中挑选结合力最强的18个进行合成，纯化，以及测试它们对血清素和其他小分子 (乙酰胆碱, γ-氨基丁酸等等) 的荧光反应。测试后，作者再从18个变体中选择对荧光反应最强的，而不与乙酰胆碱反应的变体(变体编号7，命名iSeroSnFR0.0) 再做优化。经过测试iSeroSnFR0.0对血清素的荧光反应对比iAChSnFR得到了18倍的提升。

第二步，作者使用随机森林算法对之前计算出的数据进行训练，对iSeroSnFR0.0的各个位点对血清素结合力影响的重要性进行排序，选择影响最大的4个位点使用点饱和突变技术，对其中的一个或者两个位点进行改造，得到2576个变体。经过荧光测试后，发现其中100个变体对比iSeroSnFR0.0的荧光反应有2到3倍的提升。数据分析显示实验结果与随机森林算法几乎吻合，值得注意的是单个突变对提高血清素的结合力效果有限，大幅度提高结合力需要多个突变。

第三步，因为突变的效果不是简单叠加的，作者使用广义线性模型算法对实验数据进行分析，了解单个突变点在不同情况下对整体效果的影响。广义线性模型算法在所有位置都预测出在几种有益的氨基酸突变，选择其中13种变体进行合成测试后，发现iSeroSnFR0.1变体对比iSeroSnFR0.0在荧光反应有8倍的提升，与血清素的亲和力有2倍的提升。

之后对随机森林预测的其他位点增加测试数量，产生新的实验数据，以及结合作者之前设计传感器的实验经验，经过两轮实验，作者成功得到最优的变体iSeroSnFR。

随后，作者对iSeroSnFR进行一系列测试和应用。首先作者将iSeroSnFR表达到哺乳动物(HEK293T) 细胞表面，也可以能通过神经胶蛋白将其表达到突触后。两种条件下，iSeroSnFR都能够固定在细胞膜表面并对不同浓度的血清素有清晰的反应。特异性测试显示iSeroSnFR对大部分小分子不发生反应，仅对色胺和多巴胺有反应。动力学测试显示在10到40秒后传感器荧光会达到饱和。经过实验分析，荧光激活有两个不同相，慢相发生在初始期，荧光强度会快速升高 (特征时间0.5-10 ms)，之后达到慢相，荧光会慢慢逐渐达到饱和 (特征时间5-18s)。利用这个性质，可以让传感器达到毫秒级的时间分辨率。之后作者将这项技术应用在实验中，能有效探测小鼠在恐惧状态，社交活动，以及睡眠唤醒转变中的血清素释放。同时他们也发展了血清素转运蛋白的临床测定方法来用于研发药物。

综上所述，作者通过机器学习和点饱和突变技术相结合的方法，来指导血清素传感器的荧光蛋白设计，能大大减少搜索空间，并大幅度提高传感器性能。更重要的是，设计其他传感器也可以借鉴这个思路。

https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.11.040

制版人：Kira

参考文献

1. Charnay, Yves, and Lucienne Léger. "Brain serotonergic circuitries."Dialogues in clinical neuroscience12.4 (2010): 471.

2. Broussard, Gerard J., et al. "Imaging Glutamate with Genetically Encoded Fluorescent Sensors." Biochemical Approaches for Glutamatergic Neurotransmission. Humana Press, New York, NY, 2018. 117-153.

3. Marvin, Jonathan S., et al. "A genetically encoded, high‐signal‐to‐noise maltose sensor."Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics79.11 (2011): 3025-3036.

4. Packer, Michael S., and David R. Liu. "Methods for the directed evolution of proteins."Nature Reviews Genetics16.7 (2015): 379-394.

5. Shivange, Amol V., et al. "Determining the pharmacokinetics of nicotinic drugs in the endoplasmic reticulum using biosensors."Journal of General Physiology151.6 (2019): 738-757.

6. Bender, Brian J., et al. "Protocols for molecular modeling with Rosetta3 and RosettaScripts."Biochemistry55.34 (2016): 4748-4763.