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Cell | Tn7-CRISPR-Cas转座系统向导RNA的功能特化

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  撰文 | 木兰之枻

  责编 | 兮

  作为原核生物的免疫系统,CRISPR-Cas系统在细菌和古细菌中广泛存在。此外,为更好的适应环境,原核生物还会“改造”CRISPR-Cas系统,以借助其中的向导RNA靶向特定位点。原核生物“改造”CRISPR-Caas系统的一个实例便是Tn7-like转座子中编码的CRISPR-Cas系统:这一Tn7-CRISPR-Cas转座系统可在向导RNA的引导下实现定向转座,并在2019年被研究者改造用于大片段DNA在细菌基因组中的定向整合(详见BioArt报道:专家点评Science+Nature长文| 当CRISPR遇上转座子——实现位点特异性DNA片段的高效、特异插入)【1,2】。不过研究者对Tn7-CRISPR-Cas转座系统的认识相当有限,转座子系统与传统CRISPR-Cas系统相互配合的机制依然有待研究,这也极大的限制了该系统的改造及在生物医学研究中的应用。

  2020年12月02日,来自美国康奈尔大学微生物学系的Joseph E. Peters实验室在Cell发表题为Guide RNA Categorization Enables Target Site Choice in Tn7-CRISPR-Cas Transposons的论文。文章通过数据挖掘和相关实验对细菌中的I-F3型Tn7-CRISPR-Cas系统进行了汇总和分类。研究指出,I-F3型Tn7-CRISPR-Cas系统均可利用相应的向导RNA实现定向转座。此外Tn7-CRISPR-Cas系统演化出多种机制保障向导RNA功能的特化,以避免其对传统CRISPR-Cas系统的干扰而引发宿主毒性。

  

  在对超5.3万种γ-变形菌的基因组进行数据挖掘后,研究者发现了802种I-F3型Tn7-CRISPR-Cas系统,并根据转座子插入位点的不同将其分为I-F3a和I-F3b两大类。在随后的CRISPR阵列(CRISPR arrays)分析中,研究者发现Tn7-CRISPR-Cas系统中所有的转座插入位点都有对应的向导RNA,这表明相关的转座事件都是在向导RNA的引导下实现。研究还发现,介导转座的向导RNA编码序列在CRISPR阵列中的位置都相对固定。此外,它们的重复序列(repeats)也迥异于阵列中其它向导RNA的重复序列,为此,研究者称其为非典型重复序列,而对应的向导RNA也被称为非典型向导RNA。而后的转座实验证实,与经典的向导RNA相比,这类非典型向导RNA介导转座的能力更强,而且转座能力的增强与非典型重复序列密切相关。

  Tn7-CRISPR-Cas系统中的向导RNA与传统I-F型CRISPR-Cas系统的向导RNA并无明显区别,随之而来的问题便是:转座子的向导RNA是否会被传统的CRISPR-Cas系统所用,从而导致染色体降解和宿主毒性?研究者指出,转座子的向导RNA的确能被传统的CRISPR-Cas系统利用。不过,介导转座的向导RNA有独特之处:其间隔序列(spacer)中常可见很多碱基错配,无法完美匹配靶位点序列。虽然这种错配对转座影响甚微,但却会严重干扰传统CRISPR-Cas系统发挥功能。此外,非典型重复序列也会干扰传统CRISPR-Cas系统的功能,因此Tn7-CRISPR-Cas系统可通过向导RNA的错配以及非典型重复序列两种机制来避免其对传统CRISPR-Cas系统的干扰。

  不过在I-F3a系统中,介导转座的向导RNA难以通过非典型重复序列避免对传统CRISPR-Cas系统的干扰。研究者发现,Tn7-CRISPR-Cas系统还编码一种保守的Xre蛋白,它在I-F3a系统中可严格调控CRISPR阵列的转录和向导RNA的产生;而在I-F3b系统中,Xre则调控系统中关键蛋白的表达。Tn7-CRISPR-Cas系统进入新宿主时,Xre蛋白还未表达,向导RNA和关键蛋白会迅速高表达以介导转座的发生;随后Xre蛋白表达增加,在I-F3a系统中抑制向导RNA的产生,在I-F3b系统中则抑制关键的蛋白的产生,最终抑制Tn7-CRISPR-Cas系统的功能,避免其对传统CRISPR-Cas系统的干扰以降低对宿主的毒性。

  

  图1 Tn7-CRISPR-Cas转座系统的示意图及向导RNA功能特化的机制

  总体而言,本研究通过数据挖掘和生信分析,对I-F3型Tn7-CRISPR-Cas系统进行了系统的总结。此外,研究还对介导转座向导RNA的特点及功能特化进行了探索,发现I-F3型Tn7-CRISPR-Cas系统可通过向导RNA间隔序列的错配、非典型重复序列以及Xre蛋白的精细调控三种策略保证向导RNA功能的特异性,避免其对传统I型CRISPR-Cas系统产生干扰而引发宿主毒性。这一研究对Tn7-CRISPR-Cas转座系统向导RNA的改造和未来应用都有重要的指导意义。

  https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.11.005

  
制版人:嘉

  参考文献

  1. Klompe, S. E., Vo, P. L. H., Halpin-Healy, T. S. & Sternberg, S. H. Transposon-encoded CRISPR–Cas systems direct RNA-guided DNA integration. Nature 571, 219–225 (2019)

  2. Strecker, J. et al. RNA-guided DNA insertion with CRISPR-associated transposases. Science 365, 48–53 (2019)

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