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相对定量,你的内参选对了吗

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  荧光定量 PCR 的主要用途之一即是相对定量,而提到相对定量,必然离不开内参,那什么是内参基因,为什么相对定量必须使用内参,如何选择正确的内参基因?我们今天就来聊聊关于内参的那些事。

  

  什么是内参?

  内参基因,也称为管家基因,其编码蛋白是维持细胞基本生命活动所必须的蛋白质。它的表达水平不受任何内源性与外源性因素的影响。管家基因高度保守且在大多数情况下持续表达,稳定表达于不同类型的细胞和组织中。

  

  为什么相对定量必须使用内参?

  那内参基因与相对定量又有什么样的关系呢?我们通过以下实验案例一起了解一下。

  实验目的:测定肝癌细胞 X 基因相对于正常肝细胞的表达量。通过荧光定量检测可得:肝癌细胞中 X 基因的 CT = 25,正常肝细胞中 X 基因的 CT = 26,所以,利用表达量倍数计算公式 2-△CT 计算,发现肝癌细胞中的 X 基因表达量是正常肝细胞表达量的 2 倍。

  

  但是,上面这个定量结果检测有效的前提是:必须保证两盘细胞的细胞数量完全一致;RNA 提取、逆转录以及定量效率及操作必须完全一致;不存在操作误差等。这显然是无法达到的。

  那如何才能使这些误差不影响 X 基因表达检测的真实性呢?

  这时,为了将样本处理归一化,引入一个内参进行校正。基于前面对内参基因特点的描述,我们知道内参基因在两类细胞(正常肝细胞/肝癌细胞)中的表达量是相对一致的,所以可以对细胞上样量、细胞上样过程中存在的误差、实验过程中存在的实验误差等进行校正。再来看一下引入内参后 X 基因的表达量。

  

  肝癌细胞 X 基因 CT = 25,内参基因 CT = 20;正常肝细胞 X 基因 CT = 26,内参基因 CT = 22。所以,内参校正后,肝癌细胞中的 X 基因表达量是正常肝细胞表达量的 1/2 倍(计算公式 2-△△CT)。

  由此可见,若想有效检测一个特定基因的相对表达情况,选择内参进行归一化处理非常重要!

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  如何选择合适的内参?

  理想状态下的内参应在各种实验条件下,各种类型的组织和细胞中恒定表达,且表达量稳定。那是否在实验中只要选择一个常见的内参就可以了呢?

  我们来看下面这个案例:

  

  这份资料中描述了不同内参基因在不同的组织中的表达情况。以 B2M 内参基因为例,其在胎儿大脑与白细胞中的表达量相差数百倍。若使用 B2M 对胎儿大脑与白细胞中某一基因的表达量进行校准,得到结果显然是不可信的。

  那如何来选择合适的内参呢?

  首先,是内参的获得;常见内参获取的途径有如下三个:

  

  •   途径一:通过查询相关文献,获取内参。

      

  •   途径二:选择常用的多个内参进行实验验证。

      

  较常见内参基因见下图表:

  

  

  •   途径三:通过查询 ICG 库,获取内参。

      

  网址:http://icg.big.ac.cn/index.php/Homo_sapiens。网站中搜集了文献报道的常见细胞/组织适用的内参。如 ICG 库中收录的肺癌常见细胞系对应的内参基因有 ACTB、PPIA、PGK1。

  

  其次,是内参的验证;选定的内参是否满足你的实验,是否在你的不同实验组中是稳定表达的呢?

  我们先一起来了解下这个案例:

  

  该实验主要目的:NIH 3T3 细胞系在无血清培养基中培养 24 h 后,添加 15% 血清,观察 8 h 内一特定基因的表达量。本实验选取了两个内参基因:GAPDH 与 β-2-microglobulin 进行实验验证。在不同实验组下,通过利用 2-△CT(△CT = CT,Time x - CT,Time 0)计算得到 9 个数据,通过进行统计学分析,判定这 9 个数据差异是否显著。实验结果表明,GAPDH p < 0.0001,差异极显著,β-2-microglobulin p = 0.2345,差异不显著。说明 GAPDH 在该实验模型中表达不稳定,不建议将 GAPDH 作为该实验的内参。

  通过这个案例可以知道,验证内参时,其一、尽可能选用多个内参同时进行实验,其二、通过在不同样本处理上的表达差异检测情况,来选择合适的内参。

  综上可见,在相对定量检测中,最重要的是选择合适的内参基因;而选择合适的内参基因中,最重要的,则是验内参基因在不同处理间的表达稳定性。选择合适的内参,是相对定量成功的开端!

  内参基因如何选择,您掌握了吗?

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  参考文献:

  1.Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data bygeometric averaging of multiple internal control genes[J]. Genome Biology .2002 June; 3(7):research0034.1–0034.11.

  2.The MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments[J]. Clinical Chemistry.2009. January; 55:4 611–622

  3.Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitative PCR and the 22DDCT Method[J].. METHODS .2001; 25, 402–408.

  文章来源:诺唯赞

  图片来源:诺唯赞

  题图来源:站酷海洛

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