Nat Methods | 纳米孔测序同时获取染色质可及性和甲基化信息

撰文 | 阿童木

责编 | 兮

近年来随着DNA测序技术的蓬勃发展，蛋白质结合位点的高通量鉴定、染色质可及性（chromatin accessibility）及甲基化状态分析等检测技术不断涌现，其中很多技术（如DNase-seq和ATAC-seq等）依赖于开放性染色质对转座酶等的敏感性【1,2】。在这些新技术中，NOMe-seq（nucleosome occupancy and methylome sequencing）能够利用外源性M. CviPI GpC甲基转移酶标记基因组可及性区域，结合亚硫酸氢盐转换，NOMe-seq能够同时检测内源性胞嘧啶甲基化和核小体开放性状态【3】。

纳米孔测序（Nanopore sequencing, 又称第四代测序）是近年来兴起的新一代单分子测序技术，具有测序读长（reads）长（>150 kb），速度快，测序数据实时监控，机器方便携带等优点。之前研究已证明纳米孔测序能够检测内源性CpG甲基化，并能对酵母甚至人类细胞的染色质可及性位点进行外源标记【4,5】。

2020年11月23日，约翰霍普金斯大学Winston Timp教授领导的研究团队在Nature Methods杂志发表了题为“Simultaneous profiling of chromatin accessibility and methylation on human cell lines with nanopore sequencing”的研究文章，作者通过GpC甲基转移酶外源性标记开放染色质后，利用纳米孔测序技术（nanoNOMe-seq）同时检测了人类细胞中的内源性CpG甲基化状态和染色质可及性的阶段性模式，构建了涵盖甲基化和染色质开放性信息等在内的人类细胞表观基因组，并利用该技术揭示了乳腺癌细胞和非癌细胞间的表观遗传差异。nanoNOMe-seq为我们揭示人类发育与疾病发生中复杂的染色质表观遗传学特征提供了新的技术支持。

作者之前开发的nanopolish软件能够检测纳米孔测序数据中的CpG甲基化【4】，本研究中作者对该软件进行training使其不仅能识别CpG甲基化，还能准确检出GpC甲基化。之后，作者对细胞内的开放染色质区域实现GpC甲基化标记后，利用纳米孔测序技术进行了nanoNOMe-seq，在确定测序质量良好的前提下，作者分析了内源性甲基化水平及染色质可及性（图1）。结果表明，nanoNOMe-seq检出的CpG甲基化与之前的亚硫酸盐全基因组测序（whole-genome bisulfite sequencing，WGBS）结果高度一致，而通过分析GpC甲基化频率得出的染色质可及性数据与经典的ATAC-seq和DNase-seq结果显著重合。

图1 nanoNOMe技术原理与梗概

以往研究表明，即使在同类细胞群体中，核小体足迹（footprint）和染色质可及性也会存在异质性，这凸显了在单个测序读长（reads）水平上解析表观遗传模式的重要性，但由于GpC甲基转移酶活性变化以及单分子检测的噪声（noise）问题，nano-NOMe-seq 对GpC可及性的单reads分析存在困难。为去除孤立的测序噪声，作者利用同一分子邻近GpC基序信息来估计特定位点的染色质可及性。对单个reads上CTCF（CCCTC-binding factor）结合位点的可及性和甲基化模式进行评估后，作者证明该方法能够降低可及性检测中的测序误差，并保留了对核小体足迹（footprint）的追踪能力。

在高表达基因的转录起始位点（transcription start sites，TSS）附近，作者发现核小体定位有序，染色质开放水平更高，随着表达量的降低，单reads水平上CpG甲基化上升，TSS周围的染色质可及性降低。在追踪亚核小体足迹过程中，作者检测了TSS附近GpC位点的数量对区分具有开放和闭合启动子测序读长的影响，并发现随着基因表达上调，活性一致的测序reads（低CpG甲基化和高可及性）增加，非一致活性的测序reads（高CpG甲基化和低可及性）减少。此外，TSS 1 kb内具有常染色质H3K4me3组蛋白修饰基因的CpG甲基化较低，而具有异染色质H3K27me3修饰的基因其reads的染色质可及性较低。具有二价组蛋白修饰（H3K4me3和H3K27me3）的启动子区域上的大多数reads同时具有低CpG甲基化和低染色质可及性。作者检测TSS 10 kb内的亚核小体足迹后发现，具有可及性启动子的reads中的亚核小体足迹读长比具有不可及性启动子的reads要高，表明nanoNOMe-seq能够获得与活性启动子状态相关的蛋白结合事件等信息。

由于纳米孔测序会产生长的reads，每个reads遇到杂合子单核苷酸多态性的几率更大，因此可用来将reads相位（phase）到母系或父系起源。构建人类细胞基因组DNA甲基化和染色质可及性的全基因组等位基因特异性图谱后，作者比较了常染色体基因、X染色体失活(XCI)基因和X染色体上XCI逃逸基因在TSS附近的甲基化和可及性，结果表明活性X染色体上的基因（Xa，母体等位基因）表现为去甲基化和启动子区域的可及性；而非活性X染色体上的基因（Xi，父系等位基因）表现为甲基化和启动子的不可及性，而在常染色体基因和逃逸基因中，两个等位基因总体上无显著差异。分析父系和母系等位基因间甲基化或染色质可及性存在显著差异的区域后，作者发现虽然二者之间的重叠区域不多（6%），但重叠区域表现出高度一致性趋势，即甲基化增加，染色质可及性降低，反之亦然。此外，纳米孔测序产生的长reads能够用于检测常规的短读长测序无法发现的结构变异、大片段插入与缺失以及转座事件，作者发现尽管大多数结构差异在等位基因间的甲基化水平上没有明显差异，但在那些变异的等位基因中，缺失突变往往表现出低甲基化和插入突变往往表现出高甲基化。

图2 癌细胞中ZNF714基因TSS区域的蛋白结合及表观遗传特征发生变化

最后，作者利用nanoNOMe-seq检测了三种特征明确的乳腺细胞系之间的表观遗传差异。首先，作者发现乳腺癌细胞的两个亚型MCF-7 和MDA-MB-231的甲基化差异区域中低甲基化区域数量高于高甲基化区域的数量，表明乳腺癌细胞整体上表现为低甲基化。分析染色质可及性差异区域后，作者发现乳腺上皮细胞MCF-10A可及性区域要多于两种肿瘤细胞。此外，表观遗传差异主要富集在转录因子结合位点和启动子附近的调控区域，尤其是CTCF结合位点。其次，作者检测了不同细胞间是否存在基因结构变异，发现两种癌细胞基因组上存在1个特异性插入突变，该突变下游1 kb区域表现出高甲基化水平和染色质不可及性，表明癌细胞基因组变异与表观遗传学变化具有相关性。第三，作者评估不同细胞表观遗传状态和亚核小体足迹差异后，发现两种癌细胞中表达上调基因ZNF714的TSS区域中更多reads处于激活状态（非甲基化和染色质可及性高），并且在启动子中具有亚核小体足迹，表现出潜在的蛋白结合活性（图2），ChIP–qPCR也证明了癌细胞中该区域转录复合体显著富集。上述结果共同表明，癌细胞中ZNF714的表达上调与TSS附近的表观遗传活性增强和亚核小体足迹变化同时发生。

综上所述，本研究中作者基于纳米孔测序技术开发了一种能够同时检测CpG甲基化和染色质可及性的测序方法——nanoNOMe-seq，该技术所具有的单分子分辨率实现了对染色质上蛋白质结合和核小体足迹的追踪，并能确定启动子附近区域的表观遗传特征，使在单分子水平上构建由复杂表观遗传信息构成的人类表观基因组成为可能。

https://doi.org/10.1038/s41592-020-01000-7

参考文献

1. Boyle, A. P. et al. High-resolution mapping and characterization of open chromatin across the genome.Cell132, 311–322 (2008).

2. Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y. & Greenleaf, W. J. Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position.Nat. Methods10, 1213–1218 (2013).

3. Kelly, T. K. et al. Genome-wide mapping of nucleosome positioning and DNA methylation within individual DNA molecules.Genome Res22, 2497–2506 (2012).

4. Simpson, J. T. et al. Detecting DNA cytosine methylation using nanopore sequencing.Nat. Methods14, 407–410 (2017).

5. Wang, Y. et al. Single-molecule long-read sequencing reveals the chromatin basis of gene expression.Genome Res29, 1329–1342 (2019).

制版人：Kira