Plant Cell | 中科院分子植物卓越中心巫永睿团队发现玉米籽粒发育与灌浆核心调控因子

编者按

2020年11月23日，中科院分子植物科学卓越创新中心巫永睿团队在The Plant Cell在线发表题为The B3 Domain-Containing Transcription Factor ZmABI19 Coordinates Expression of Key Factors Required for Maize Seed Development and Grain Filling的研究论文。该研究发现，玉米籽粒早期发育（胚乳和胚的形态建成）与灌浆起始（胚乳和胚的储藏物质合成）这两个紧密衔接又相对独立的生长发育过程受到转录因子ZmABI19的协同调控。

The Plant Cell在“In Brief”栏目同时刊发了题为A Hub of Hubs: The Central Role of ZmABI19 in the Regulatory Network of Maize Grain Filling的文章，对该工作进行了介绍。

玉米作为世界上产量最高的粮食和饲料作物，既是许多发展中国家人口的主食，又是畜牧业肉、蛋、奶生产的主要原料。玉米胚乳和胚 （盾片部分） 都是玉米籽粒营养储藏器官，主要储藏物质分别为淀粉和醇溶蛋白 （zein） 以及油和球蛋白 （globulin） ，因此研究玉米籽粒发育与灌浆调控对品质和产量的遗传改良至关重要。玉米胚乳的早期发育 （授粉后0-8天） 主要是通过细胞快速分裂形成灌浆期胚乳绝大部分细胞以及分化成四种不同功能的胚乳组织。早期发育结束后，胚乳开始启动灌浆，淀粉合成途径相关基因和醇溶蛋白编码基因几乎同时激活表达，它们的mRNA转录本迅速增加，其中醇溶蛋白基因的转录本占到了胚乳细胞所有转录本的60%以上。

胚乳发育和储藏合成受到复杂而又精密的遗传网络调控。目前已报道了多个转录因子直接调控储藏物质合成，比如O2, PBF1, ZmbZIP22, MADS47, NAC128/130, OHP1/2, O11等，其中O2, PBF1, ZmbZIP22, NAC128/130和O11为胚乳特异表达的转录因子，暗示这些转录因子本身也可能受到某些上游因子的共同调控。O2属于bZIP家族转录因子，是胚乳灌浆调控的一个关键转录因子。O2调控绝大多数醇溶蛋白基因表达，还直接调控淀粉合成途径关键基因SSIII，PPDKs以及蔗糖合酶编码基因Sh1，Sus1和Sus2表达。它使储藏物质合成从底物到产物的代谢途径上受到高度协同的转录调控。因此克隆和解析O2上游调控基因及分子机制是破解胚乳灌浆起始信号的重要突破口。

巫永睿团队利用不同长度的O2启动子测试其转录活性，发现起始密码子上游400-500 bp为O2转录活性的关键区域，该区域有多个DNA顺式结合元件。其中可信度最高的是两个RY-motif及二者中间的一个O2-box。前人已有报道O2转录因子能结合自身启动子上的O2-box而产生转录激活，那么识别RY-motif的B3转录因子很可能就是要寻找的O2上游转录因子。玉米基因组预测有51个B3转录因子，其中37个在玉米籽粒中表达。该研究团队利用酵母单杂技术对这37个B3转录因子进行逐个验证，然后通过EMSA和转录激活实验，最终发现只有ZmABI19能识别并转录激活O2启动子，而且当两个RY-motif同时存在时才能发挥最大转录活性。ZmABI19的转录和蛋白水平在籽粒早期表达时最高，灌浆开始后表达水平下降，而且胚中的mRNA水平显著高于胚乳，暗示ZmABI19在籽粒早期发育和灌浆期都有调控作用，而且可能同时调控胚和胚乳发育。通过CRISPR-Cas9技术敲除ZmABI19，纯合突变中O2基因的mRNA和蛋白水平剧烈下降，O2下游调控的醇溶蛋白基因表达也随之明显下降，这在遗传上证明了ZmABI19直接调控O2表达。由于PBF1能显著增强O2的转录激活活性并且表达模式和O2几乎完全一致，巫永睿研究团队发现ZmABI19也能通过识别RY-motif直接调控Pbf1表达。zmabi19纯合突变体籽粒的胚乳和胚均发育均异常，成熟籽粒变小并粉质，不能萌发。RNA-seq表明zmabi19在胚乳中显著影响营养储存库活动 （Nutrient reservoir activity） 以及淀粉和糖代谢途径，在胚中影响植物激素信号转导以及脂肪代谢。联合转录组 （RNA-seq） 和染色质免疫共沉淀 （ChIP-seq） 分析发现ZmABI19不仅调控O2和Pbf1，还直接调控其它多个胚乳特异表达的灌浆调控转录因子 （ZmbZIP22, O11, NAC130） 和胚乳基底转运层定位的糖转运蛋白基因SWEET4c。另外，ZmABI19还直接调控胚发育与盾片储藏物质合成的核心转录因子Vp1以及多个植物激素相关因子。以上研究表明ZmABI19是协同籽粒早期发育与灌浆起始的核心转录因子。

中国科学院分子植物科学卓越创新中心/植物生理生态研究所博士后杨桃和博士生郭亮星为本研究论文共同第一作者，副研究员王海海、王婕琛，博士生冀晨、郑喜喜、肖俏合作参与了该项研究工作。中国科学院分子植物科学卓越创新中心巫永睿研究员为通讯作者。研究工作得到了中科院先导B和国家自然科学基金项目的资助。

研究背后的故事

植物中最早克隆的B3家族的转录因子是玉米中调控种子休眠的基因Viviporous1 （Vp1） 。拟南芥作为双子叶模式植物其胚胎发生 （embryogenesis） 及种子成熟 （seed maturation） 的分子调控机制研究非常深入。三个B3家族转录因子 LEAFY COTYLEDON 2 （LEC2） ，ABSCISIC ACID INSENSITIVE 3 （ABI3） 和 FUSCA3 （FUS3） ，以及一个 HAP3家族 CCAAT-box 结合因子 （ LEC1） 构成了一个称之为LAFL的核心调控网络。其中ABI3是玉米VP1的同源蛋白，氨基酸序列保守，功能也可以彼此互补。然而，FUS3和LEC2在单双子叶植物间的序列变异却非常大。早在2013年，我们就希望通过蛋白序列比较寻找FUS3在玉米中的同源蛋白，然而得到的比对结果显示同源关系最近的ZmABI19的相似性只有24.6%，而且主要集中在B3结构域。我们当时从美国突变体库要了这个基因的突变体，通过鉴定发现一个Mu7 Cy转座子插入了ZmABI19的最后一个外显子，但是没有引起籽粒任何表型。由于我们本来就不确定该基因就是拟南芥FUS3的同源基因，而且要到的突变体没有表型，这个材料就没有再继续往下分析了。

2017年，我们通过大量的酵母单杂筛选和一系列实验 （转录激活和EMSA） 验证，证实了ZmABI19是O2的上游调控因子。而zmabi19-Mu没有表型，我们就开始怀疑Mu7 Cy转座子是否真的让ZmABI19失活了。通过RT-PCR和Western检测，我们发现在zmabi19-Mu中ZmABI19基因的转录本和蛋白水平和野生型几乎一致，而且蛋白的大小几乎也一致。我们用3’RACE扩出了zmabi19-Mu新的3’端cDNA，发现zmabi19-Mu招募了Mu7 Cy的部分序列进行转录，形成了和原来ZmABI19大小差不多的编码序列。由于Mu7 Cy的插入位点在B3结构域和转录激活域的后面，ZmABI19-Mu对O2启动子的转录激活活性没有受到明显影响，这就解释了为何zmabi19-Mu没有出现突变表型。然后我们利用基因编辑技术对ZmABI19进行敲除，获得了多个功能缺失突变体，终于对ZmABI19的功能进行了遗传验证。

https://doi.org/10.1093/plcell/koaa008