Science | 闫靖等开发新型抑制剂治疗神经退行性疾病

撰文 | Qi

责编 | 兮

N-甲基-D-天冬氨酸受体（N-methyl-D-aspartate receptors,NMDARs）是谷氨酸门控的钙离子可渗透性神经递质受体。它们是大脑发育的基础，控制成年人的突触可塑性，并且启动整合神经系统适应性过程（例如记忆和获得性神经保护）所需的转录应答【1】。然而，NMDAR也可能对神经元有害，因为它们同样可以关闭（shut-off）存活相关基因的表达，导致线粒体功能障碍，从而引起由过量谷氨酸诱导的兴奋性毒性细胞死亡【2-4】。NMDARs的这种双刃剑（The NMDAR paradox）现象解释了临床试验中旨在抑制NMDAR有害信号的拮抗剂的使用并没有对神经元提供保护作用的原因。然而截至目前，毒性NMDAR信号的分子机制仍然未知。

2020年10月9日，来自德国海德堡大学的Hilmar Badin课题组（第一作者为闫靖博士）在Science杂志上发表了一篇题为“Coupling of NMDA receptors and TRPM4 guides discovery of unconventional neuroprotectants”的文章，在这项研究中，作者证明兴奋性毒性是由NMDAR与TRPM4在突触外的物理偶联所致，应用互作界面抑制剂可以破坏两者的结合，从而缓解毒性并维持NMDAR正常生理功能。作者提出，重组或小分子NMDAR/TRPM4界面抑制剂的研发为保护神经元以及减轻当前无法治愈的人类神经退行性疾病症状提供了机会。

首先，作者假设NMDAR信号的有害作用是由与其他蛋白质的特定相互作用引起的，并将候选蛋白的重点放在瞬时受体电位（transient receptor potential, TRP）通道家族的成员上。其中TRPM亚群曾被报道参与神经退行性变，且TRPM4被确认为NMDAR死亡信号复合体的关键组成部分【5】。作者通过使用重组腺相关病毒（rAAV）介导的TRPM4特异性shRNA的表达，敲低海马神经元TRPM4，发现能够显着降低NMDA诱导的兴奋性毒性。紧接着，NMDAR与TRPM4的物理偶联在免疫共沉淀实验中得到验证：作为介导NMDAR兴奋性毒性的亚基，GluN2A和GluN2B均在体外培养的神经元以及小鼠脑中存在与TRPM4的相互作用；相反，在TRPM4和GluN1亚基之间，以及与AMPA型谷氨酸受体亚基GluA2之间都没有发现类似的相互作用。因此，作者认为GluN2A和GluN2B与TRPM4的特异性物理偶联介导了NMDAR的毒性反应。

那么，作者猜测是否可以通过破坏NMDAR/TRPM4复合体（N/T复合体）相互作用即可消除NMDAR介导的毒性呢？作者鉴定TRPM4的633-689位氨基酸所处的结构域（命名为TwinF），在两种急性神经退行性疾病模型中提供了强大的神经保护功能。进一步地分析TwinF的结构特征发现，TwinF包含多个α螺旋，并在其中心处形成带有两个苯丙氨酸Phe666和Phe667的袋状结构，将Phe666和Phe667突变为丙氨酸（TwinF-F2A2），会导致TwinF失去针对NMDAR介导的毒性的神经保护作用；而将Phe666和Phe667突变为结构非常相似的酪氨酸（TwinF-F2Y2），则在很大程度上保留了TwinF的神经保护活性。免疫共沉淀实验也再次证明，失活的TwinF-F2A2不能破坏N/T复合体，而具有功能的TwinF和TwinF-F2Y2则可以与内源性TRPM4竞争性的与NMDAR结合，从而破坏内源性N/T复合体并提供神经保护。

接下来作者想知道，GluN2A和GluN2B中的哪部分结构域负责与TRPM4的结合呢？作者通过对GluN2A和GluN2B的氨基酸序列比对分析，发现这两个亚基在胞内域仅有少数重合。从而进一步通过实验鉴定出一段含有18个氨基酸的肽段，除一个氨基酸有差异外其余均相同。该区域包含四个规则间隔的异亮氨酸，且在鸟类和哺乳动物中高度保守（GluN2A的Phe861至Glu878；GluN2B的Phe862至Glu879），因此被称为“I4”结构域，而GluN1，GluN2C，GluN2D和GluN3中没有I4。将中央两个异亮氨酸Ile868和Ile872突变为丙氨酸后，则会破坏它的功能。

值得注意的是，TwinF在体外和体内均具有强大的神经保护活性，这为将来的临床应用带来了希望。但就目前而言，将rAAV立体注射至大脑并不适用于人类，而通过口服或静脉内施用小分子才是较为可行的治疗方法。因此，作者进行了基于TwinF结构的计算药物筛选，并从134万个候选分子中筛选中192个潜在的小分子N/T界面抑制剂，进一步的实验则确认并明确了化合物8和19的神经保护作用：（1）化合物8和19均可显著降低GluN2A和GluN2B与TRPM4的结合以及NMDA诱导的海马神经元细胞死亡，且作用效果与分子浓度存在正向线性关系；（2）化合物8和19可以阻止NMDA诱导的海马神经元线粒体功能障碍；（3）化合物8即使在高浓度也不具备细胞毒性，而高浓度的化合物19则会损害神经元健康；（4）这两种化合物不会阻断NMDAR的电流和细胞内钙信号；（5）化合物8对钙离子激活的TRPM4通道活性没有影响，而高浓度的化合物19可抑制TRPM4通道，这种差异可能是由这两种小分子与TRPM4相互作用部位不同引起的；（6）解释了化合物8和19可以消除NMDA诱导的转录因子CREB的阻断途径并恢复ERK1/2激活，从而减轻与NMDAR介导的毒性相关的转录失调。

图1，破坏NMDAR / TRPM4相互作用的新型化合物 (图片版权：Yan et al., Oct. 2020 Science/AAAS.)

最后，作者想知道小分子N/T互作界面抑制剂是否可以在动物体内提供神经保护作用。根据上述测试结果，最终选定化合物8来完成体内验证。作者使用了两种神经退行性疾病的小鼠模型：MCAO诱发的缺血性中风和玻璃体内注射NMDA诱发的视网膜神经节细胞 （RGC）变性。通过腹腔注射化合物8后2小时，GluN2A/TRPM4复合物形成减少26％，6小时减少36％；GluN2B/TRPM4复合物在2小时形成减少38％，而在6小时减少36％。最终，作者观察到化合物8使MCAO中风模型中小鼠的大脑损伤显著减少；此外，化合物8还强力的阻止了NMDA诱导的RGC死亡。该实验证实在动物模型中，化合物8对兴奋性毒性诱导的神经细胞损伤有强力的保护作用。

图2，NMDAR / TRPM4作用界面抑制剂的神经保护模型 (图片版权：Yan et al., Oct. 2020 Science/AAAS.)

总的来说，这项研究表明兴奋性毒性是由于NMDAR与TRPM4的物理偶联所致，这与当前“NMDAR过度活化和钙超载”的观点相反。因为神经突触中没有TRPM4分子的分布，因此N/T复合体是在突触外形成的，这也这解决了长期存在的谜团，即根据其位置（突触与突触外）的不同，NMDAR可以分别促进神经元存活或死亡。此外，这项研究的结果证实可以通过重组蛋白TwinF或小分子N/T界面抑制剂去特异性的抑制毒性NMDAR的信号，同时保留NMDAR的关键生理功能。这种药理作用方式提供了一种全新的治疗原理，并不像传统的NMDAR拮抗剂一样损伤大脑的认知和记忆功能。TwinF和化合物8作为新型的N/T界面抑制剂，在治疗目前无法治愈的人类神经退行性疾病，例如阿尔兹海默症、肌萎缩性脊髓侧索硬化症等中具有巨大潜力。

https://science.sciencemag.org/content/370/6513/eaay3302

制版人：Kira

参考文献

1.R. G. M. Morris, NMDA receptors and memory encoding. Neuropharmacology 74, 32–40 (2013). doi: 10.1016/ j.neuropharm.2013.04.014; pmid: 23628345

2.D. W. Choi, Ionic dependence of glutamate neurotoxicity. J.Neurosci.7, 369–379 (1987). doi: 10.1523/JNEUROSCI.07- 02-00369.1987; pmid: 2880938

3.S. A. Lipton, P. A. Rosenberg, Excitatory amino acids as a final common pathway for neurologic disorders.N. Engl. J. Med.330, 613–622 (1994). doi: 10.1056/NEJM199403033300907; pmid: 7905600

4.G. E. Hardingham, Y. Fukunaga, H. Bading, Extrasynaptic NMDARs oppose synaptic NMDARs by triggering CREB shut-off and cell death pathways.Nat. Neurosci.405–414 (2002). doi: 10.1038/nn835; pmid: 11953750

5.B. Schattling et al., TRPM4 cation channel mediates axonal and neuronal degeneration in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis.Nat. Med.18, 1805–1811 (2012). doi: 10.1038/nm.3015; pmid: 23160238