四轴打印微纤维管状支架与气管软骨的应用

长段缺损仍然是肾小管组织重建临床治疗中的主要问题。设计适合于肾小管组织再生的具有理想结构和功能的管状支架仍然是再生医学领域的一大挑战。

在这里，研究团队提供了一种可靠的方法，通过四轴打印系统快速制备具有分层结构的组织工程管状支架。该制备工艺可适用于各种生物材料，包括水凝胶、热塑性材料和热固性材料。

以聚己内酯(PCL)为例，研究团队成功地制备出管状结构可调、网孔结构可控、径向弹性好、弹性好、管腔通透性好的支架。作为该技术应用的初步展示，将四轴印刷弹性聚癸二酸甘油(PGS)生物弹簧与电纺明胶纳米纤维相结合，制备了一种杂化管状支架。通过体外培养和裸鼠皮下移植，种植软骨细胞的支架均可形成管状成熟软骨样组织，在气管软骨重建中显示出巨大的潜力。

在本文中，Dong Lei团队开发了通过四轴打印系统快速制备具有分层结构的组织工程管状支架。该制备工艺可适用于各种生物材料，包括水凝胶、热塑性材料和热固性材料。通过体外培养和裸鼠皮下移植，种植软骨细胞的支架均可形成管状成熟软骨样组织，在气管软骨重建中显示出巨大的潜力。

原文链接：https://doi.org/10.1007/s40843-019-9498-5

血管、气管、尿道等管状组织是人体的重要器官。癌症和创伤往往会导致他们的疾病和长节段缺损。临床治疗中对肾小管组织重建的需求很大。目前，临床上使用的管状替代物大多是由聚四氟乙烯(EPTFE)的聚四氟乙烯(EPTFE)编织而成。然而，由于替代性异物长期植入体内，这类移植物缺乏生物活性。

组织工程学为血管、气管、胃肠道和尿路等管状器官的功能重建提供了一种很有前途的解决方案。管状器官的特点是复杂的结构和机械性能，它们负责特定的功能。近年来组织工程学的发展和令人振奋的结果表明，迫切需要研究以特殊和准确的方式设计的更复杂的结构。这给组织工程学带来了额外的挑战，以便通过使用各种细胞和支撑材料系统的组合来构建完整的器官。

在再生医学中已经进行了许多尝试来开发功能性管状支架。模塑法是将高分子生物材料加工成合成管状支架的通用方法。但该方法处理步骤复杂，结构调整不便。摘要电纺是制备纳米纤维管状支架的一种有效方法，它具有可裁剪、适合空心功能的特点，但是，由于纳米纤维的生产效率较低，这种方法也存在耗时的问题。准备空心脚手架可能需要几个小时。此外，电纺法主要适用于塑料材料。因此，有必要开发一种通用的方法，将各种生物材料加工成形貌可控、可调的管状支架。

在这里，研究团队使用四轴打印系统快速制造具有编织结构的微纤维管状支架。这种方法的通用性很强，很容易应用于各种材料，包括热塑性材料、热固性材料和水凝胶。通过控制相关参数，可以方便地剪裁出各种宏观形貌和微观结构的管状支架。为了展示其用途，将四轴印刷弹性生物弹簧与电纺纳米纤维相结合，制备了一种混杂管状支架。当复合软骨细胞时，该复合管状支架在体内外均能再生出与天然气管软骨相似的强度和弹性的满意的管状软骨。

图1.从各种材料制备管状支架的4轴打印系统示意图

图2.打印了不同几何形状的PCL管状支架。不同直径(a，b)的管状脚手架；俯视(C)和剖视(D)的圆形管状脚手架的SEM；三角棱镜接收器(E)和相应的管状脚手架(F)；俯视(G)和剖视(H)的三角管脚手架的SEM；六棱柱形接收器(I)和相应的管状脚手架(J)；俯视(K)和剖视(L)的六角形管状脚手架的SEM。

图3. PCL管状支架的微观结构和力学性能。印刷过程示意图(A)和交织纤维网络结构(B)；各种微观结构的管状支架的照片(C)；不同密度的交错纤维的扫描电镜图像(d-g)；三维打印的PCL管状支架10个循环的循环压缩(H)和拉伸(I)试验

图4.具有可控结构参数的可预测和可重现打印。螺距(A)、纤维间距(B)、直径(C)和织物角度(D)与转速的关系曲线

为了展示四轴打印技术的潜在应用，研究团队制备了一种混杂管状组织工程支架，并在体外和体内验证了其在工程管软骨中的有效性。PGS生物弹簧用作混合管状支架的内部支撑结构(图6A，b)。明胶电纺成纳米纤维，很容易沉积在外层的间隙和内部弹簧中(图6C)。静电纺丝是生产纳米纤维结构的一种有效技术，它模仿天然基质加速细胞粘附生长。

图5.制造水凝胶支架和多孔热固性生物弹簧的4轴打印策略的多功能性。藻酸盐/聚丙烯酰胺管状水凝胶支架的照片((A)俯视图；(B)红色染料可视化；(C)充满水的水凝胶支架；(D)PGS生物弹簧的印刷和交联(D)；柔性和弹性PGS生物弹簧(E)；剖面图中具有层次结构的PGS生物弹簧的扫描电镜((F)管结构；(G)编织纤维；(H)微孔结构)。

图6.用于混合管状组织工程支架的可升级生物弹簧。具有外部纳米纤维结构(A)和内部PGS生物弹簧(B)的混合支架示意图；PGS/明胶复合管状支架的光学图像(C)；具有管状结构(D)、双层结构(E)和纳米纤维外表面(F)的支架的扫描电镜图像。

首先对混杂管状支架的生物相容性进行了评价。细胞接种后(图7A，b)，活/死荧光显微照片和凋亡染色显示软骨细胞能够在复合支架上有效增殖，显示出良好的生物相容性和低凋亡率(图7D-G)。与荧光显微照片一致，DNA含量也证实杂化支架与对照组无统计学差异(p>0.05)(图7C)，提示杂化支架可能是一种理想的软骨细胞增殖支架。

图7.复合支架的生物相容性。复合支架与对照组(单纯培养液)(C)细胞增殖无明显差异，细胞接种后活体和死亡染色显示细胞在体外培养1d(D)~4d(E)出现增殖，体外培养1d(F)~4d(G)几乎未见细胞凋亡。细胞核染成蓝色，凋亡细胞染成绿色。

评估混合管状支架在体外构建管状软骨的能力(图8)。体外培养8周后，杂化管状支架形成软骨样组织(图8a，b)。组织学检查显示软骨细胞在支架表面增殖，并分泌软骨细胞外基质形成管状软骨(图8C)，GAG(图8D)、胶原纤维(图8E)和Ⅱ型胶原(图8F)染色阳性，表明软骨细胞在支架表面增殖，并分泌软骨细胞外基质(ECM)，形成管状软骨(图8C)，GAG(图8D)、胶原纤维(图8E)和II型胶原(图8F)染色阳性。结果表明，杂化管状支架适合软骨细胞的增殖和分化。满意的软骨形成与多孔的纳米纤维结构有关，它模仿自然基质，促进细胞粘附生长和营养渗透，从而促进软骨的均匀分布。综上所述，这些结果表明杂化管状支架是一种理想的管状软骨体外再生支架。

图8.体外工程化管状软骨。细胞接种8周后，样品保持其原有的管状形态，形成软骨样组织，软骨形态成熟(a，b)，HE(C)、藏红花O(D)、Masson‘s三色(E)和II型胶原(F)组织学分析显示，工程软骨呈现典型的陷窝结构和软骨特异性的细胞外基质沉积，并伴有复合支架的逐渐降解。黄色箭头表示支架残留物；黑色箭头表示软骨成熟。

图9活体管状软骨再生。经过2周的培养和12周的体内移植，样品成功地再生出相对均匀的成熟管状软骨，具有典型的陷窝结构(a，b)和软骨特异性ECM沉积((C)HE；(D)藏红花-O；(E)Masson‘s trichrome；(F)II型胶原)，定量分析表明，复合软骨细胞组(支架和细胞)的湿重(G)、厚度(H)和DNA含量(J)指标最高，组间差异显著；在杨氏模量(I)、GAG含量(K)、总胶原含量(L)等定量指标上，支架+细胞组仍明显高于单纯支架组(无细胞)，但略低于新鲜正常气管软骨组。绿色箭头表示正常结缔组织；黑色箭头表示新生组织；黄色箭头表示残留支架。统计学意义：**p<0.01

综上所述，研究团队建立了一种简单的4轴打印技术，以快速制造和定制具有不同宏观几何形状和微米级可控多孔纤维编织结构的管状结构比例。这种印刷方法通用性强，可以很容易地应用于各种材料。这项技术为构建广泛的管状组织的组织工程支架提供了一种强有力的方法，该技术的应用被证明可以有效地工程气管样软骨组织。此外，该技术还可用于其他生物医学应用，如血管内支架和外部支架。