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北大开发新型光敏,实现Cas9高时空分辨率调控

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撰文:nagashi

CRISPR-Cas系统是一种十分强大的基因编辑工具。近年来,CRISPR技术通过Cas蛋白靶向基因并对其进行定点操作,从而突变或修正靶基因。与此同时,CRISPR技术还在基因治疗、核酸定位以及核酸检测等领域展现出良好的应用前景。

由此看来,作为一种目前广泛使用的基因编辑工具,对具有高时空分辨率的CRISPR/Cas9系统进行精确控制是研究基因调控和编辑的必要条件。

近日,北京大学药学院天然药物及仿生药物国家重点实验室汤新景团队在 Angewandte Chemie 杂志上发表了题为:Optical Control of a CRISPR/Cas9 System for Gene Editing by Using Photolabile crRNA 的研究论文【1】。

这项研究开发了一种新型的光控crRNA(向导RNA)——通过维生素E和5'末端的光敏基团来灭活CRISPR/Cas9系统。维生素E修饰不影响Cas9/crRNA/tracrRNA核糖核蛋白复合物(RNP)的形成,但会抑制RNP与靶DNA的相互作用。

通过这一特殊的光控CRISPR/Cas9系统成功实现了光诱导的人类血管内皮细胞生长因子A (VEGFA)基因组编辑,并降低了EGFP稳定表达细胞系中的EGFP表达。这种crRNA-caged策略为CRISPR/Cas9系统介导的基因编辑的时空光调控提供了新的方法

究其根源,CRISPR-Cas系统是一种广泛存在于原核及古核生物的免疫系统,Cas蛋白具有许多种亚型,其中Cas9蛋白是目前最常用的基因编辑系统。CRISPR-Cas系统可以摄取外源DNA片段,并将其插入到自身的间隔序列中,新的间隔序列转录的crRNA引导Cas蛋白特异性切割与之互补的DNA序列。

但值得注意的是,在传统的CRISPR-Cas9基因编辑过程中,crRNA引导Cas蛋白在正确的位置与DNA结合并不是立即发生的,有时需要几个小时。这意味着CRISPR-Cas9基因编辑具有延时性

因此,CRISPR-Cas9基因编辑过程经常观察到不必要的脱靶效应。由此可见,对CRISPR-Cas9功能进行高时空分辨率的精确控制,有利于减少脱靶效应,提高其特异性和作为研究/治疗应用的强大工具的潜力

目前,已有一些研究尝试控制CRISPR-Cas9系统的活性释放,其中一种常用的方法是通过添加一个阻断序列,该序列与crRNA的间隔区杂交,从而阻断Cas9/crRNA/靶DNA复合物的形成,然后再以不同的方式打开阻断序列/间隔序列的杂交区域,从而恢复CRISPR-Cas9系统的活性。

在此项研究中,研究人员设计并构建了一个光调控的新型笼状CRISPR-Cas9系统——以一种新的、具有5'末端维生素E修饰的光敏crRNA为核心。研究团队首先合成了硝基苯乙二醇和维生素E的亚磷酰胺单体,然后偶联到crRNA的5'端,再从固体树脂中分离得到笼状crRNA(维生素E-PL-crRNA),然后进行进一步纯化和表征。

光调节CRISPR/Cas9诱导DNA编辑的原理图

实验结果证实,在非光照条件下,维生素E修饰能阻断Cas9/crRNA/tracrRNA/靶DNA复合物的形成;而在365nm紫外光照射下,维生素E与crRNA的光敏连接被去除,从而恢复CRISPR-Cas9系统的切割活性。

紧接着,研究人员还评估了笼状crRNA在不同光照时间下的光敏性,他们发现在4min的光照射下,维生素E将完全脱离笼状crRNA。

笼状crRNA在5'端进行维生素E修饰,阻断Cas9介导的DNA切割

为了进一步验证笼状crRNA控制CRISPR-Cas9系统的能力,研究人员还进行了体外DNA切割实验:crRNA/tracrRNA/Cas9蛋白1小时裂解靶DNA的效率约为58%,而笼状crRNA/tracrRNA/Cas9蛋白在相同的时间内仅观察到不到6.6%的靶DNA切割。

这表明维生素E修饰对CRISPR-Cas9系统的活性有十分明显的抑制作用。更重要的是,在光照射4min后,观察到Cas9诱导的靶DNA切割增强了7.6倍,效率恢复为50.2%,与阳性对照十分接近。

研究团队还探究了笼状crRNA阻断CRISPR-Cas9功能的具体机制。他们研究了Cas9蛋白与crRNA/tracrRNA双链和靶DNA的相互作用,并发现维生素E修饰不影响Cas9/crRNA/tracrRNA复合物的形成,但会抑制该复合物与靶DNA的相互作用。

除此之外,研究人员还在HEK293T细胞系中验证了笼状crRNA控制人类细胞基因编辑的能力,他们成功实现了光诱导的人类血管内皮细胞生长因子A (VEGFA)基因组编辑,并降低了EGFP稳定表达细胞系中的EGFP表达。

针对HEK293T细胞VEGFA位点的Cas9/caged crRNA VEGFA/tracrRNA的基因组编辑活性

无独有偶,今年6月,美国约翰霍普金斯大学的研究人员在 Science 杂志上发表的题为:Very fast CRISPR on demand 的研究论文【2】。也提出了开发光敏crRNA的研究思路,从而利用光照精确操控基因编辑的时间

总而言之,汤新景团队的这项研究提供了一种调控CRISPR-Cas9系统活性的全新开发思路,并成功在体外切割实验和人源细胞系中验证了其有效性。由此可见,笼状crRNA的确可以应用于基础研究中的基因编辑

该论文的第一作者张瑜表示:“笼状crRNA易于固相合成,且与其他核酸修饰相兼容,具有十分良好的应用前景,我们的笼状crRNA-CRISPR/Cas9系统仅需合成不同的笼状crRNA,就能用于不同的靶点,这比以前报道的诱导性sgRNA更方便。”

参考文献:

[1] https://doi.org/10.1002/anie.202009890

[2] https://science.sciencemag.org/content/368/6496/1265

责任编辑:贾翰鼎_NBJ10744

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