半月板再生：3D打印PCL-MECM的水凝胶混合支架

半月板是一对楔形纤维软骨组织，位于相应的股骨髁和胫骨平台之间，其主要功能是充当垫子，通过增强稳定性，重新分配载荷和吸收震动来保护关节软骨免于超负荷。然而，一旦受伤，半月板的自我修复潜力有限，尤其是在内部区域，血液供应仅分布在周围区域的10％至25％之间。手术技术和异体移植是半月板修复的主要途径，但这些在临床实践中存在固有的局限性。近几年，组织工程为再生严重受损的半月板的提供了一条新的途径，但用于构建弯月面再生支架的生物材料（如合成聚合物，水凝胶和组织衍生的材料）很难再现类似于天然半月板组织的自然微环境。

因此，郭全义团队通过3D打印以楔形聚（ε-己内酯）（PCL）为骨架的支架，注入优化的半月板细胞外基质（MECM）的水凝胶，并用半月板纤维软骨细胞（MFCs）接种。结果显示MECM基水凝胶在促进MFCs细胞增殖和基质形成表型方面有一定的优越性，而且这种混合支架产生了良好的生物力学性能，接近天然半月板，可促进兔的整个半月板再生。基于细胞的PCL-MECM的水凝胶混合支架可能是未来半月板再生的全新策略。

发表在ACS Appl. Mater. Interfaces杂志上题为“PCL-MECM-Based Hydrogel Hybrid Scaffolds and Meniscal Fibrochondrocytes Promote Whole Meniscus Regeneration in a Rabbit Meniscectomy Model”的文章，来自中国人民解放军总医院骨科研究所的郭全义团队。

图1 总体研究设计示意图

首先，研究团队制备了五种浓度基于MECM的水凝胶，并根据其促进细胞增殖的能力和MFCs的基质形成表型选择了最佳水凝胶。水凝胶的宏观视图和SEM图像（图2A、B）显示所有的MECM基水凝胶都具有相互连接的多孔结构。水凝胶的孔径和孔隙率随着MECM浓度的增加而减小。在4%的组中观察到孔径和孔隙率的急剧下降，而其他组的孔径大于150μm，孔隙率大于80%，有利于细胞的生长和增殖。

从三维重建图像中可以看出细胞在MECM基水凝胶中均匀分布，并且定量分析表明所有组的细胞活力均大于90%。此外，在2%的组中观察到更多的活细胞，表明2%MECM基水凝胶可能更有利于细胞增殖。用RT-PCR(图3E)和GAG和胶原定量(图3F)评价了基于MECM的水凝胶促进去分化MFCs基质形成表型的能力，结果表明，所有MECM基水凝胶中都发现了胶原I、胶原II、SOX9和聚集蛋白聚糖的明显上调，其中，2%组软骨形成标志物的表达水平明显高于其他组，即2%MECM基水凝胶作为组织工程的理想生物材料具有很大的潜力。

图2 (A)宏观特征、(B)SEM图像、(C)孔径和(D)五种浓度的MECM基水凝胶的孔隙率

图3 (A)在基于MECM的水凝胶中培养7天的MFC的活/死细胞染色和(B)

活力分析；图像显示了死细胞（红色），活细胞（绿色）以及基于MECM的水凝胶中MCFs分布的3D重建图像。(C)培养1、4、7和14天后，封装在基于MECM的水凝胶中的MFCs的CCK-8分析。(D)DNA含量；(E)与在单层培养中的P3处的MFCs相比，在基于MECM的水凝胶中培养的MCFs的胶原I，胶原II，SOX9和聚集蛋白聚糖的表达。(F)在不同时间点的细胞/水凝胶构建体的总GAG和胶原蛋白。

接下来，基于微CT图像和天然兔半月板胶原纤维排列的三维立体定向纤维楔形多孔PCL支架。将优化后的MECM基水凝胶注入三维打印多孔PCL支架中，构建混合支架。多孔PCL支架充当提供机械强度和解剖形状的骨架，而基于MECM的水凝胶充当模仿MFCs天然微环境的细胞递送系统。由应力应变曲线计算压缩和拉伸模量，混合支架的压缩模量为6.54±0.88MPa（天然半月板：3.76±0.14MPa），混合支架的拉伸模量为34.64±2.34MPa（天然半月板：45.58±1.30MPa）。结果表明，与天然半月板相比，混合支架具有良好的机械性能，足以承受力和保持完整的结构。

图4 (A)兔半月板的生成过程。(B)混合支架和天然半月板的压缩和拉伸模量。(C) 1周和1个月混合支架体内免疫反应的H&E图像

最后，根据宏观、组织学、生化、生物力学和图像评估，将PCL、PCL水凝胶和PCL水凝胶-MFCs支架植入兔膝关节，以评估其在植入后3个月和6个月的半月板再生潜力和软骨保护作用。与PCL-水凝胶和PCL组相比，PCL-水凝胶-MFCs组中新半月板的大小和形状较优，GAG和胶原蛋白含量显著较高，再生半月板的拉伸和压缩模量均显著提高，并且术后6个月未发现骨关节炎征象，软骨下骨仅轻度硬化。PCL-水凝胶-MFCs组中的再生半月板显示出更有效的预防软骨变性，这与再生半月板的质量相符。

图5 (A) 支架植入和实验分组模式。蓝色箭头表示保存完好的内侧副韧带。(B)植入后3个月和6个月膝关节的宏观观察，切除的半月板显示在右边。(C)手术后3个月和6个月的半月板覆盖率。

图6 (A)再生半月板的组织学染色和免疫组织化学分析。(B)股骨髁和胫骨平台软骨的H&E染色图像。(C)再生半月板组织学评分。(D)胶原蛋白和GAG的总含量。(E)再生半月板的拉伸和压缩模量。