人乳头瘤病毒E6&E7 mRNA与宫颈病变关系的研究进展

导语：

流行病学研究已证实人乳头瘤病毒（human papillomavirus,HPV）感染是子宫颈癌（宫颈癌）发生和发展的首要因素。HPV DNA联合细胞学检测筛查可提高宫颈癌的检出率，减少假阴性；但HPV DNA只是病因检测，无法判断病毒的活动程度，不能对宫颈病变的进展进行风险评估。由于E6和E7是HPV的癌基因，其表达产物E6和E7蛋白是致癌的关键，因此，E6和E7成为研究的热点。2006年欧洲生殖感染和肿瘤研究组织（European Research Organization on Genital Infection and Neoplasia,EUROGIN）取得了共识，认为HPV E6/E7 mRNA检测应作为宫颈癌筛查的重点研究内容。本文对HPV E6/E7 mRNA的相关研究进展进行综述，探讨更为有效的宫颈筛查方法。

1、HPV E6/E7生物学特性及其与肿瘤的关系

HPV早期编码区E6、E7基因时病毒癌基因。研究表明，癌基因E6、E7的表达是宫颈上皮内瘤变（cervical intraepithelial neoplasia,CIN）和宫颈癌发生的必要步骤，其表达产物E6、E7蛋白是致癌的关键。

E6蛋白通过E6相关蛋白（E6 associated protein,E6-AP）介导与抑癌蛋白p53结合，经过泛素途径使其讲解，使细胞绕过细胞周期G1/S和G2/M检查而转向恶性增殖；另外，E6通过阻断p53依赖的细胞凋亡途径阻止细胞凋亡，使基因异常的细胞得以持续增殖，最终导致细胞永生化和宫颈癌的发生。E7蛋白可特异性结合视网膜母细胞瘤蛋白（retino-blastoma protein,pRb），pRb最重要的功能是与细胞转录因子E2F结合形成特异性pRb/E2F复合物，后者可以作为转录抑制因子，负向调控G1/S期的变，抑制细胞周期的进展。E7蛋白特异性结合pRb后导致pRb/E2F复合物无法形成，从而促进G1/S期的转变和细胞分裂增殖加速。此外，E7蛋白也可使细胞周期相关负向调节因子p27和p16失活，使细胞生长停滞信号收到抑制，造成细胞周期紊乱，引起细胞无限增殖并向恶性转化，E6、E7联合作用可使有丝分裂纺锤体形成缺陷和中心体数目异常，导致染色体异常、基因不完整以及多倍体细胞的出现，促使细胞恶变和肿瘤的发生。有研究表明：通过干扰RNA沉默E6、E7基因可抑制宫颈癌细胞的生长，并引起癌细胞凋亡；此外，HPV E6和E7癌基因在宫颈癌的浸润转移中起着重要作用，E6和E7癌基因在宫颈癌的浸润转移中起着重要作用，E6和E7与上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）密切相关。EMT是恶性肿瘤浸润转移的重要机制，通过下调黏附分子的表达使细胞间接触力降低同时细胞流动性增强，使细胞恶性肿瘤细胞远处转移。E6和E7通过激活EMT转录因子Slug、Twist、ZEB1和ZEB2，使细胞发生EMT样改变，增强恶性细胞的侵袭力，是恶性细胞浸润转移。同时，E6和E7还可影响宿主的免疫功能，如干扰素应答基因被干扰，E6与干扰素调节因子3结合、E7与干扰素调节因子1结合，抑制干扰素应答启动，导致病毒逃逸免疫系统的监视，促进肿瘤的进展。

2、HPV E6/E7 mRNA在宫颈病变组织中的表达意义

E6/E7 mRNA是癌基因E6和E7的转录产物，其表达水平体现了癌基因的活性。研究发现：HPV E2基因对E6和E7基因有负调节作用，当HPV DNA整合进入宿主细胞时，由于整合往往造成E2基因缺失，使得E6和E7失去E2的负调节而过度表达，在宫颈上皮全层可检测到E6/E7 mRNA。

张凤芹等发现：宫颈鳞状细胞癌患者E6/E7 mRNA拷贝数（15516.40~246410.89/ml）远高于有HPV感染而无CIN患者（40.530~2069.02/ml），不同分级的宫颈病变HPV E6和E7 mRNA与HPV DNA表达比例为1:3~5:6，且均随病变程度加重而增加。当HPV DNA整合进入宿主细胞后表现为持续性HPV感染，而持续性高危HPV（high risk HPV,HR-HPV）感染是宫颈癌发生的主要因素，宫颈组织中E6/E7 mRNA阳性表明有HPV感染且病毒癌基因处于活动期，宿主细胞发生恶性的风险性较高，故对于HR-HPV感染且E6/E7 mRNA阳性的妇女应给予足够的重视。为此，Srbye等提出对于年龄＞40岁HR-HPV感染患者，当阴道镜下宫颈活检结果正常，若E6/E7 mRNA阳性，为安全起见，需要进行治疗。

对于HR-HPV阳性以及E6/E7 mRNA阳性的妇女应缩短重复筛查间隔时间。Cattani等研究发现，55.8%的CIN2患者以及4.6%的CIN3患者E6/E7 mRNA检测结果为阴性，因而一个阴性的HPV E6/E7 mRNA结果并不完全代表宿主不存在进展风险，由于持续HR-HPV感染到发生宫颈癌是一个漫长的过程，在这期间，病毒癌基因有时处于静止期，此时癌基因呈现无表达，宫颈脱落细胞E6/E7 mRNA检测为阴性；此外，当细胞癌变时，若癌细胞使细胞基因重排、插入、突变以及基因沉默等，则可造成E6、E7无转录，E6/E7 mRNA检测也为阴性。因此，对于HR-HPV阳性E6/E7 mRNA阴性的妇女仍需长期随访观察。

3、HPV E6/E7 mRNA的检测方法

由于单链RNA稳定性较差，在标本采集、固定和检测中都容易破坏mRNA的完整性而使得检测结果出现假阴性而漏诊。最初时学者研究如何成功地从石蜡包埋的组织标本检测出E6/E7 mRNA。随着研究的进展，Habis等证实了宫颈脱落细胞保存液中的标本也可保持mRNA的稳定性；Waldstrm等 成功地从保存3年的宫颈脱落细胞保存液中检测出HPV E6/E7 mRNA；Cuschieri等则提出临床常见取材的宫颈组织标本中HPV mRNA稳定，可用于检测。目前常用的检测标本仍是宫颈液基细胞保存液中的宫颈脱落细胞。HPV mRNA传统的检测方法包括Real-Time PCR、依赖核酸序列的扩增技术（nucleic acid sequence-based amplification,NASBA）和支链DNA技术（branch DNA，bDNA）等。Real-Time PCR是较早用于mRNA检测的方法，应用最为广泛；而NASBA是在PCR基础上发展起来的一种新的扩增技术，与PCR不同的是其由1对引物引导，敏感度和特异度强，安全性好；bDNA技术是一种核酸探针信号放大检测技术，近些年也被应用于HPV检测，其最主要的优势在于实现对核酸的定量检测。在传统检测检测技术的基础上，目前商业化生产的用于临床的检测方法有Aptima、Quantivirus、Pretect HPV-Proofer和NuliSENS Easy Q等。

4、HPV E6/E7 mRNA检测在宫颈病变筛查中的应用

4.1 评估宫颈病变进展风险以及分流HPV感染

目前，HPV检测大多数针对病毒DNA，HPV DNA检测用于宫颈癌筛查的敏感度和特异度都高于细胞学检查。但大部分患者HPV感染后可通过自身免疫功能进行清除，且HPV感染到发生癌前病变和癌变是一个漫长的过程，只有少部分HPV感染才会引起宫颈病变，因此，HPV DNA检测对宫颈病变的风险预测过早。而癌基因E6和E7的表达是导致宫颈细胞恶性转化并发展至宫颈癌的必要步骤，相对于HPV DNA检测，E6/E7 ，mRNA检测能够更精准地预测细胞向高度病变和癌症转变的可能性。Moden等对77例30岁以上细胞学为意义未明的不典型鳞状细胞病变（atypical squamous cells of undetermined significance,ASCUS）和低度鳞状上皮细胞内病变（low grade squamous intraepithelia lesion,LSIL）的妇女同时实施HPV DNA检测和E6/E7 mRNA检测，为期2年的随访发现，E6/E7 mRNA阳性的妇女进展为CIN2+的概率是阴性妇女的69.8倍，HPV DNA阳性的妇女进展为CIN2+的概率是HPV DNA阴性妇女的5.7倍。Rossi等提出阴道镜下活检结果为CIN1或正常的mRNA阳性妇女和mRNA阴性的妇女进展为CIN2+的概率分别为每年18.4‰和3.6‰。Tinelli等的一项随访研究发现，mRNA阳性而活检正常的妇女进展为CIN的平均时间为12个月。因此，在细胞学和HPV DNA检测基础上再进行E6/E7 mRNA检测，根据E6/E7 mRNA结果对妇女进行分层管理并定制个性化的筛查间隔时间可能更为合理，可避免过度频繁的随访给患者带来的经济和心理负担。

4.2 在宫颈癌筛查中的应用

目前，用于宫颈癌筛查的主要是细胞学联合HPV DNA检测，两者的检测结果不能给出病变的明确级别，尤其对于宫颈低度病变，一项高危型HPV DNA阳性可能会让医师建议患者行阴道镜检查或病理活检。研究证实细胞学和HPV DNA检测的特异度和阳性预测值低于HPV E6/E7 mRNA检测。Benevolo等对489例细胞学异常和HPV DNA阳性的妇女进行E6/E7 mRNA检测和阴道镜活检，发现217例mRNA阳性的妇女中有121例活检结果为CIN2+，272例mRNA阴性的妇女中仅53例活检结果为CIN2+。Castle等对531例标本行E6/E7 mRNA检测，结果发现49例CIN3患者中有46例阳性，6例宫颈癌患者全部阳性。以上研究结果表明：HPV E6/E7 mRNA排除可疑或低度病变的能力更强，能够将更多无进展的病变重新归入常规的筛查管理中，可有效减少对疾病严重程度的误判，减轻过度诊断和治疗给患者带来的经济和心理压力。此外，对细胞学异常或HR-HPV阳性患者的随访发现，HPV E6/E7 mRNA检测比重复细胞学检测更有价值。因此，若将E6/E7 mRNA作为宫颈癌的二线筛查方案，可更有效地筛查宫颈癌。

4.3 在CIN患者术后随访中的应用

宫颈锥切术是治疗CIN2+的主要方法，但病灶不完全清除仍会导致宫颈癌的发生，目前主要通过病理学检查判断切缘阴性与否评估病灶清除是否彻底。对于宫颈病变切缘阴性的患者，锥切术后的复发率仍有5%~15%，因此对于CIN治疗后的随访内容主要是细胞学和HPV DNA，但两者对于预测术后病灶复发的敏感度高而特异度低，导致临床医师的过度诊断和过度治疗。因此有学者提出将HPV mRNA检测用于CIN术后随访，但对于其预测术后复发的能力仍存在争议。Frega等认为其敏感度和阴性预测值高于HPV DNA检测，HPV mRNA用于预测宫颈病变复发的敏感度为73.5%，阴性预测值为97.0%，HPV DNA则分别为44.0%和93.0%；但Zappacosta等和Tinelli等的研究证实：HPV E6/E7 mRNA预测CIN术后复发的特异度和阳性预测值高于细胞学联合HPV DNA检测，认为HPV mRNA能够更早且更为有效地预测术后病灶复发。因此对于E6/E7 mRNA用于预测CIN术后复发的临床价值仍有待进一步研究。

5、结语

宫颈癌是威胁妇女健康的恶性肿瘤之一，也是目前唯一可以预防的妇科恶性肿瘤，通过早期筛查及干预可以有效地阻止CIN向宫颈癌进展。HPV与宫颈癌的关系密切，HPV癌基因E6和E7在宫颈癌的发生和发展中发挥重要作用。对癌基因表达产物E6和E7蛋白检测的难度较高，分子检测技术的研究更多聚焦于癌基因转录产物E6/E7 mRNA，其对判断宫颈病变的严重程度具有重要价值。随着对HPV认识的加深及分子生物学研究的进展，宫颈细胞分子标志物已成为研究热点，如L1蛋白，p16等，作为众多宫颈细胞分子标志物中有潜在可能应用于临床宫颈癌筛查的E6/E7 mRNA，其临床应用推广尚需大样本量的随机对照试验以及长期的随访研究。

摘自上海交通大学学报 2014年 第35卷 第5期《人乳头瘤病毒E6/E7 mRNA与宫颈病变关系的研究进展》